应用rna干扰技术对旋毛虫nudix水解酶基因功能的研究

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1、学校代码10459学号或申请号201212161818密级公开硕士学位论文应用RNA干扰技术对旋毛虫Nudix水解酶基因功能的研究作者姓名：张帅兵导师姓名：王中全教授学科门类：理学专业名称：动物学培养院系：生命科学学院完成时间：2015年4月AthesissubmittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterThefunctionidentificationofTrichinellaspiralisNudixHydrolasegengbyRNAinterferenceByShuaibingZhan

2、gSupervisor:ZhongquanWangZoologySchooloflifesiciencesApril,2015学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的此硕士学位论文，是在导师的指导下，独立进行科学研究所取得的成果。除文中已注明引用的内容外，本论文不含有任何其他个人或集体已发表或撰写过的科研成果。对本论文的研究作出贡献的个人和集体，均已在文中标明。声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：多dp日期：年05•月日学位论文使用授权声明本学生在导师指导下完成的论文及相关的科研作品，知识产权都归属郑州大学。根据郑州大学有关保存和使用学位

3、论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门和机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学木论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：^

4、rapL日期：2年月^0日本研究受国家自然科学基金项目（No.81371843，81271860和81471981)资助。Thisworkwassupportedbythe

5、NationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81371843,81271860and81471981)摘要应用RNA干扰技术对旋毛虫Nudix水解酶基因功能的研究硕士研究生张帅兵导师王中全郑州大学基础医学院寄生虫学教研室（郑州450052）河南省分子医学重点学科开放实验室（郑州450052）摘要Nudix水解酶（Nudixhydrolase,Nd）是一种广泛存在于多种生物体内的一种水解酶。它可以水解多种有机焦磷酸盐，包括核苷二磷酸盐、核苷三磷酸盐、二核苷酸多磷酸盐、二磷酸肌醇多磷酸盐、核苷酸糖和RNA

6、帽端。本实验室的前期研究发现旋毛虫Nudix水解酶（TrichinellaspiralisNd,TsNd）与旋毛虫侵入小鼠小肠上皮细胞（IEC）有关。本研究通过RNA干扰（RNAi）技术研究旋毛虫肌幼虫的TsNd基因功能，观察TsNd基因被沉默后旋毛虫幼虫在体外的存活情况、感染能力和雌虫生殖力。首先设计与TsNd同源的dsRNA和siRNA，通过浸泡法和电穿孔法将其导入到旋毛虫肌幼虫体内。然后通过Real-timePCR技术和Westernblotting技术分别幼虫TsNd基因转录水平和蛋白表达水平的变化。结果发现，dsRNA和siRNA均

7、能导致TsNd表达明显降低。同时设计一条与旋毛虫蛋白酶体β7亚基（Tspst）同源的dsRNA，用来验证RNAi具有基因特异性，即dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst只能分别引起与它们同源的基因沉默。将dsRNA-TsNd和siRNA导入旋毛虫肌幼虫体内后，在培养过程中观察幼虫存活情况。体外观察TsNd基因沉默对旋毛虫幼虫侵入IEC的影响，动物实验观察TsNd基因沉默对旋毛虫幼虫在体内侵入肠粘膜及其发育和生殖力的影响。材料与方法1.材料本实验所用旋毛虫（T.spiralis,T1）由昆明小鼠保种和传代。pGEM-T-TsNd/I摘要M

8、109：含旋毛虫TsNd基因重组质粒菌株，由实验室前期构建和保存。pMAL-C2X-Tspst/BL21：含旋毛虫Tspst基因重组质粒菌株，由实验室前期构建和保存。实验用BALB/c小鼠：购自河南省实验动物中心。2.dsRNA和siRNA的设计与合成登陆GenBank查询TsNd和Tspst的mRNA序列。①dsRNA的设计与合成；选取TsNdmRNA650~1301bp和TspstmRNA88~742bp作为2条dsRNA的靶序列。根据靶序列设计含有T7启动子的PCR引物，以含TsNd和Tspst的重组质粒为模板PCR扩增得到含T7启动子

9、的PCR产物，即dsRNA体外转录模板，然后体外转录合成dsRNA-TsNd和dsRNA-Tspst。②siRNA的设计与合成：根据TsNdmRNA序列，设计3个s