新孢子虫mic6的鉴定、功能及其作用机制的初步研究

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1、分类兮：单位代码：密级：公开学号：博士学位论文新孢子虫的鉴定、功能及其作用机制的初步研究研究生李文生指导教师刘群教授合作指导教师申请学位门类级别农学博士专业名称预防兽医学研究方向兽医寄生虫与寄生虫病学所在学院动物医学院年月本研究获得以下项目资助国家重点基础研究发展计划（计划，项目编号：北京市自然科学基金（重点项目，项目编号：独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中已经注明引用和致谢的内容外，论文中不包含本人和其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得中国农

2、业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：时间：年月日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定。本人同意中国农业大学有权保存及向国家有关部门和机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人同意中国农业大学将本学位论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》或《中国优秀硕士学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。保密的学位论文在解密后应遵守此协议）学位论

3、文作者签名时间：年月曰摘要新孢子虫是一种专性细胞内寄生原虫，可感染多种动物。新孢子虫在入侵宿主细胞过程中会分泌大量蛋白质，微线体分泌的多种蛋白（在虫体识别、粘附细胞中发挥重要功能。关于微线蛋白的研究己经见于多种顶复亚门原虫，而新孢子虫微线蛋白的研究报道则很少。本研究以为主要研究对象，对的生物学特性、与其它微线蛋白相互作用、功能及其作用机制等进行较为系统的研究。应用生物信息学方法对进行分析，结果显示：基因全长无内含子，与弓形虫核苷酸序列的相似性是该基因共编码个氨基酸，与弓形虫氨基酸序列相似性为。利用在线分析软件发现，蛋白含有个

4、信号肽，个跨膜区，个和个低聚区，属于型跨膜蛋白。构建原核表达质粒、和，原核表达重组蛋白、和丨。用这三种蛋白分别免疫小鼠，制备、和多克隆抗体。对生物学特性的研宄显示：细胞内虫体的集中于虫体前端，而正在入侵细胞的虫体则位于虫体后端；体外入侵阻断实验结果表明，多抗可有效阻止新孢子虫入侵宿主细胞；微线蛋白分泌试验发现，当温度高于。或虫体内钙离子浓度升高时，虫体会分泌大量。对与其它相关蛋白的相互作用进行研宄。免疫共沉淀实验结果证实，与和会发生相互作用。的结果显示，分别与和丨相连，其中只含有第三个的可与发生相互作用；对带标签的幾基端蛋白

5、通过筛选出与其相互作用的蛋白是新孢子虫酸缩酶。在细胞外进行醛缩酶结合试验，表明羧基端中的色氨酸在与的相互作用中发挥重要作用，把色氨酸突变为丙氨酸后，与的结合能力明显下降。间接免疫荧光实验显示，与在虫体内部分共定位于虫体前端。构建原核表达质粒丨，表达嵌合蛋白丨与重组蛋白分别免疫小鼠，通过检测小鼠的相关免疫学指标和攻虫后脑内荷虫量，分别对和的免疫原性及对小鼠的免疫保护力进行评价。抗体检测结果表明，和都能刺激小鼠产生高滴度的抗体。细胞因子检测结果显示，小鼠免疫和后血清中含量显著升高。脑内荷虫量检测结果显示，免疫了和的小鼠在攻虫天后

6、，脑内荷虫量显著降低。以上结果说明这两种蛋白均对小鼠人工感染新孢子虫有定的免疫保护力，可作为新孢子虫疫苗研宄的候选抗原。关键词：新孢子虫，鉴定，蛋白互作，免疫效力AbstractNeosporacaninnmisanobligateintracellularparasitewhichhasaworld-widedistributionandcausesneosporosisinmanyspecies.DuringthecellinvasionbyN.caninum,secretoryorganellessecretealar

7、genumberofproteinswheninitialcontactismadebetweentheparasiteandthehostcell.Micronemeproteins(MICs)actasmajorcellularadhesionfactorsforhostcellsandparticipateinparasiterecognitionandadhesion.AlthoughnumerousreportshavedescribedtheMICs(TgMICs)inphylumApicomplexa,less

8、informationisavailableforN.canlnumMICs.Inthepresentstudy,weidentifiedN.caninummicronemeprotein6(NcMIC6)andinvestigateditsbiologicalcharacteristic