奶牛源隐孢子虫的鉴定及隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆

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安徽农业大学硕士学位论文奶牛源隐孢子虫的鉴定及隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆姓名：孙涛申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李培英；张丹俊201205 摘要隐孢子虫病(Cryptosporidisis)是由隐孢子虫f1C仰fD印Dr泐材圳感染引起的一种全球性人畜共患寄生虫病。隐孢子虫是人和动物腹泻的重要病原之一，也是人类艾滋病患者的主要致死因素之一。近年来，国内外学者对隐孢子虫病进行了较广泛而深入的研究，但合肥地区隐孢子虫种类尚不清楚。本课题旨在通过对合肥地区某奶牛场奶牛粪样中隐孢子虫的检查，获取隐孢子虫感染阳性奶牛，从阳性奶牛粪样中分离出隐孢子虫卵囊，采用形态学和分子生物学方法进行隐孢子虫虫种鉴定，为隐孢子虫病的防治提供理论依据；提取隐孢子虫卵囊的总RNA，进行反转录获得隐孢子虫cDNA，扩增隐孢子虫囊壁蛋白基因，以期为筛选研制隐孢子虫疫苗的抗原候选分子提供资料。首先采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对合肥地区某奶牛场285头成年母牛粪样进行隐孢子虫卵囊检测，饱和蔗糖溶液漂浮法检出隐孢子虫阳性奶牛5头，其感染率为1．8％；改良抗酸染色法检出隐孢子虫阳性奶牛6头，感染率为2．1％。根据隐孢子虫卵囊的形态、大小和卵形指数(长／宽)等特征对所获虫体进行形态学鉴定，饱和蔗糖溶液漂浮法检获的卵囊为椭圆形或卵圆形，大小平均为7．37um×6．13岬，卵形指数为1．20；改良抗酸染色法检获的卵囊为椭圆形或卵圆形，呈玫瑰红色，周围深染，中央淡染，大小平均为7．58肛m×6．20¨m，卵形指数为1．22，初步鉴定饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检出的隐孢子虫均为安氏隐孢子虫(cryptosporiditlmnndersoni)o其次采集饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法检测均为隐孢子虫阳性的5头奶牛粪样，分离隐孢子虫卵囊。根据隐孢子虫18srIⅢA基因和HsP70基因序列分别设计2对PCR反应引物和2对巢式PCR反应引物，以所获卵囊基因组为模板分别进行PCR反应和巢式PCR反应，对巢式PCR反应的产物进行胶回收、克隆和测序，将测序结果与隐孢子虫有效虫种的18SrIⅢA基因和HSP70基因序列进行同源性分析和进化树构建，从而确定所获隐孢子虫的种类。结果显示PCR扩增出的隐孢予虫18SrRNA基因和HSP70基因片段分别为540bp和448bp，巢式PCR扩增出的隐孢子虫18SrIⅢA基因和HSP70基因片段分别为250bp和325bp(GenBank登录号分别为JQ031803、JQ031804、JQ031805、JQ031806、JQ031807、JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ0318ll、JQ031812)，与预期片段大小基本一致；将巢式PCR产物序列与隐孢子虫相关序列进行同源性分析发现，这5株分离株18srRNA基因与安氏隐孢子虫仰fo印Drf旃”ma船如坶D”砂DQ989573序列一致性最高，两者在系统进化树上为同一分支；这5株分离株的HSP70基因片段与安氏隐孢子虫AY954892和 D0989576序列一致性最高，且在系统进化树上为同一分支，因此确定所分离的5株奶牛源隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫作乃矽幻．驴D，汹甜聊口玎沈坶D”f)。最后采集安氏隐孢子虫阳性奶牛的新鲜粪样，提取隐孢子虫总RNA，反转录得到cDNA，以单链cDNA为模板扩增出安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因部分片段，并进行克隆、测序，将测序所得序列与GeneBank已发布的隐孢子虫囊壁蛋白基因序列进行序列比对，从而确定隐孢子虫囊壁蛋白基因的突变情况。通过反转录和PCR方法扩增出安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因499bp片段，经克隆、测序及序列分析，此次扩增出的CoWP序列与登陆号为D0989570的囊壁蛋白序列同源性为100％。综上所述，本研究获得了合肥奶牛隐孢子虫分离株及其18SrRNA和HsP70基因片段，为中国隐孢子虫病的临床诊断、分子生物学检测及虫种鉴定提供了依据；扩增出的奶牛源安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因，为今后隐孢子虫疫苗的研制奠定了基础。关键词：隐孢子虫，虫种鉴定，囊壁蛋白，奶牛 AbstractC拶ptosporidiosisisaglobalzoonoticparasiticdiseasecausedby(功幻印D，．￡击甜所，、^，hichcaninf．ectedpeopleandanimals．(功fD置pDr死矗h，"isoneoftheimportantpathogenfordia—1eainhumansandanimals．ItisalsooneoftIlemaincauseofdeatllofthehumanAIDSpatients．Inrecentyears，dispitescholarshaVeamoreextensiVeandin·depthresearchonc叫ptosporidiosis，Hefeiregion(乃少tD妒D，．油“垅speciesisnotclear．ThesubiecthastakingasuIveyofinfectiveconditionof()卿．5jpDrf疣“mfbradia巧inAnhuiprovince．Wbappraisalofoocystsbyadoptedmolecularbiologytechn0109ymethodsandmo叩hologymethodsforidentificationof咖fo印Dr￡西“肌．ThetotalRNAof(h伊fDspo，．访材moocystswaSextracted．Makeareversetranscriptionfor(功幻印D，．泐zf所cDNA．COWPgenewasamplifiedbyPCRinordertoproVideinf0舯ationforthescreeningofthedeveIopmentof()咖置f加，．而讲甜聊antigenVaccinecandidatem01ecules·Firstly’285fecal舶mHefeidia巧werecheckedbysaturatedsucroseflotationtechniqueandmodifiedacid．flaststaining．Oocysts矗’omthe5positiVefecalsampleswereellipticalorovoiddetectedbyusingfloatingsaturatedsolution．Theinfectionratewas1．8％．Oocystsfi·omthe6positivefecalsampleswereellipticaloroVoiddetectedbyusingmodi行edacid．faststaining．7rheinfectionratewas2．1％．BsaedonsomecharacteristicfIeaturesuchasmorphology，size，strucmre，oVoidindex(1ength／width)，identifyingthetypeofcamelsandthemacaquessource(功fD妒D厂泐甜聊．Theoocystscapturedbyfloatingsaturatedsolutionofsucrosewasoval．shapedorovalwithmesizeoftheaVerage7．37}lm×6．13Iunandovalindexof1．20．Theoocystscapturedbymodifiedacid-f．aststainingwasovalorovoid，redroses，surroundedbydarklystained，thecen仃aIpalestainingwiththeaveragesizeof7．58¨m×6．20}Lmandtheovalindexof1．22．TheoocystscapturedbyTheoocystscapturedbyfloatingsaturatedsolutionofsucroseandmodifiedacid—fIaststainingare(乃pfo印o，|i讲甜m口刀沈培D刀ibyprelimina巧identification．Secondly，5positivefecalsinfectedby(功fD印D厂翮甜聊oocystswerecollected．C卸幻印钟触甜坍oocystsareseparated．Accordingtothesequenceofl8SrRNAgeneandHSP70gene仔om(：功fD互PD，．砌甜m，theprimersweredesignedandsynthesized．PCRreactionsandnestedPCRreactionweretakenplacewiththecomplateofC唧幻互pD，砌甜mgenome．ThenestedPCRproductswereclonedandsequenced．ThesequencingofC叫ptosporidiumparasitel8SrRNAgeneandHSP70genesequencehomologyanalysisandphylogenetictreeconstruction，inordertodetenninethetypesofCt矿P幻互pD，j疣搠 obtained·ThePCRamplified仔omtheC移p胁印lD，恸z册18SrItNAgeneandHSP70genesequencesof540bpand448bp，respectively；bynestedPCRamplifiedf的mthe咖幻印D，．fc玩坍insects18S“tNAgeneandHSP70genesequencesare250bpand325bp，respectiVely(GenBankaccessionnumberswereJQ031803JQ031804，J0031805JQ031806，JQ031807JQ031808，JQ031809，JQ031810，JQ03181l，JQ031812)，withtheexpectedfhgmentsizeisbasicallythesame；nestedPCRproductssequenceofC巧pfD印D，．f矗协msequencehomoIogyanalysisfoundthatthefiveisolatesofl8SrRNAgeneAnglehiddenCT，)Z}^D嘎pD，而觑聊日，眈，百D玎fDQ989573thehighestsequenceidenti坝bothinthephylogenetictreef．orthes姗ebrallch；fjveis01atesofHSP70genesequences◇倒∞pD厂触姗册如墩矾fAY954892andDQ989576sequenceident时andphylogeneticn-eeforthesamebranch，todetenninetheisolationofthe5cowsC仰fDspDrf坊zfmisolatesareC，yptosporiditlmnnderSoni．Atlast，positiVefecalwith咖幻置pDr泐甜聊oocytswerecollected．Tbta】RNAof铆叫n驴秽幼姗册如脚刀fwasextracted．cDNAwasampli6edbyreverse仃anscription．COWPgenewasamp“6edbyPCR．ThePCRproductionwasclonedandsequenced，andthentakenacomparisonwithsequecesofCOWPgenesf-romGeneBank．A499bpgene矗agmentwas锄plifiedbyreversetranscriptionandPCRwiththecompleteofc切foapo厂豇，勉刀，口，zc昆，博D刀f．T11esequencehomologyis100％aRercloning，sequencingandsequenceanalysisofthe锄p“fiedCOWPsequenceinGeneBankaccessionnumberDQ989570．Inconclusion，l8SrRNAandHSP70genefhgmentsofHefeicowsCt≯p幻晔坳rf折甜聊isolateswereobtainedinthisstudy．Itprovidedthebasisfortheclinicaldiagnosisofc巧ptosporidiosis，themolecularbiologyandspeciesidenti6cation．The锄p“母ingofCOWPgeneofcows(乃pfD印Dr触材聊andersoniwaslayedthefoundationfordeveloping(功幻印or￡讲材聊vaccineinthe向ture．Keywords：(功fD互pDr砌甜m，insectspeciesidentification，COW只cowIV 本项研究受下列基金资助1．国家自然科学基金项目(编号：31OO1O19)；2．安徽省自然科学基金项目(编号：070411O18)SUPPORTEDBYofChina(NO．31OO1O19)ProVincial烈O．070411O18) 主要图表土贾因砜表2一l奶牛隐孢子虫感染率⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．25图2一l合肥奶牛源隐孢子虫卵囊(饱和蔗糖溶液漂浮法，×400)25图2—2合肥奶牛源隐孢子虫卵囊(改良抗酸染色法，×1000)．．26图2—318SrRNA基因PCR扩增产物电泳图．．．⋯⋯⋯．．．⋯．27图2—418SrRNA基因巢式PCR扩增产物电泳图．．．．．⋯⋯⋯．27图2—5DNAStar分析的合肥地区奶牛隐孢子虫5个分离株18SrRNA部分序列与其它隐孢子虫株相关序列⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．．28图2—6合肥奶牛隐孢子虫5个分离株18SrRNA部分序列DNAStar聚类分析进化树⋯⋯⋯⋯⋯．．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．28图2—7HSP70基因PCR扩增产物电泳图⋯．．．⋯⋯⋯．．．．．．．29图2—8HSP70基因巢式PCR扩增产物电泳图⋯⋯⋯⋯．⋯．．29图2—9DNAStar分析的合肥地区奶牛隐孢子虫5个分离株HSP70部分序列与其它隐孢子虫株相关序列．⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．30图2—10合肥地区奶牛隐孢子虫HSP70部分序列DNAStar聚类分析进化树．．．⋯．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．⋯．．．．．．．．．⋯．⋯．31图2一llC0wP基因PCR扩增产物电泳图．⋯．．．⋯．．．．．．．．⋯．3l图2—12COWP基因测序图．．⋯．．．．．．．．．⋯．⋯⋯．⋯．．⋯．32图2—13奶牛源隐孢子虫COWP基因序列Blastn比对结果⋯⋯．33 mlnmlbpSghU主要英文缩写minutemicronletermilliliterbasepairsecondgramhourunit印mreVolutionperminuteEDTA分钟微米毫升碱基对秒克小时单位每分钟转数Etllylenedi锄inetetraactic乙二胺四乙酸acidmicroliterkDakilo．daltonPBS微升千道尔顿phosphate-bu毹redsodium磷酸盐缓冲液VIII 文献综述隐孢子虫病(Cryptosporidiosis)是一种由隐孢子虫f1C叼，pfo妒Dr油“圳感染引起的呈世界性分布的人畜共患寄生虫病【lJ。隐孢子虫能引起人和动物严重腹泻，尤其在艾滋病病人中感染率较高且危害严重12J。目前，隐孢子虫病已被视为全球腹泻病中最常见的病因之一，世界卫生组织和美国疾病预防控制中心均将该病列为新发传染病。隐孢子虫主要寄生于宿主胃肠道和呼吸道黏膜上皮细胞表面的微绒毛刷状缘的纳虫空泡内，以卵囊的形式随粪便排出体外，能通过粪口途径广泛感染人和多种脊椎动物【3】，隐孢子虫可以寄生于152种哺乳动物和30多种鸟类体内，是一种重要的人兽共患寄生虫病【4j。自1975年Nime报道首例人的隐孢子虫病以来，类似的报道不断增多【引。在美国、英国、加拿大等6大洲90多个国家至少300个地区已证明有病例存在16】，在犊牛、羔羊、仔猪中广泛流行。在我国，最先报道该病的是1986年陈义民等在兰州地区发现的犊牛隐孢子虫病，张敬伦等在广东发现鸡隐孢子虫病。随后还有更多学者先后在我国的上海、北京、安徽、陕西、四川、吉林、台湾等省市均有报道，该病在我国各地大面积广泛流行【7】。犊牛感染时引起爆发性流行，表现为一种轻度至重度的腹泻，严重时厌食、脱水、衰竭死亡，然而虽经多年研究，迄今对于隐孢子虫病尚无有效的治疗药物和预防方法，已筛选了200多种药物，但至今没有任何公认的药物对隐孢子虫有杀灭作用。很多学者认为疫苗的研究对防治隐孢子虫病有很大的潜力。迄今为止在寄生虫学领域已开展了疟原虫、囊虫、血吸虫及利氏曼虫等的核酸疫苗研究，而且动物实验已经取得了良好的保护效果，但关于隐孢子虫疫苗的研究资料较少，因此，在尚无有效药物防治本病的情况下，开展隐孢子虫疫苗的研究有着十分重要的意义。本文主要从隐孢子虫的生物学特性、检测和鉴定方法以及隐孢子虫疫苗的研究进展等方面进行综述。1隐孢子虫生物学特性1．1病原分类1895年Clarke在小鼠胃黏膜上皮细胞上观察到的游动孢子样物体，后来有学者认为它可能是隐孢子虫的内生性发育期虫体‘51。1907年，美国寄生虫学家Tyzzer在小鼠组织切片中发现了大量的鼠隐孢子虫伽f唧D，．胁掰m聊耵必)虫体‘引，其在观察这种寄生虫卵囊时，由于看不清予孢予，认为孢子也许隐匿其中，也许是不存在，故将此原虫首次命名为隐孢子虫。1910年，Tyzzer用显微镜对鼠隐孢子虫的无性发育期、 有性发育期虫体和孢子生殖过程进行了较详细的描述。他认为，这些发育阶段的虫体均系细胞外寄生，其卵囊是通过粪便排出体外【5】。1912年，TyZZer根据小鼠的隐孢子虫传播试验，发现了～个新种——小隐孢子虫(Cp删z|所)‘91。1955年slavin等报道了一种新的隐孢子虫，由于该新虫种可以引起火鸡的腹泻与死亡，他将其定名为火鸡隐孢子虫似mP昆卿翮砂。1976年Nime等首次报道人感染隐孢子虫病【10J。1993年，美国由于水源污染导致人隐孢子虫病暴发，造成40多万人发病，因此隐孢子虫病受到全世界各国的广泛关注【I¨。隐孢子虫是寄生性原虫，目前的分类地位已经明确，为顶复亚门翻p配Dmp概口夕，孢子虫纲偈∞阳劢矽，球虫亚纲仲cc砌矽，真球虫目似cDcc删，艾美耳亚目四mP，．f加矽，隐孢子虫科f1G叼，pfo妒Dr讽眈叫，隐孢子属伽D印Dr泐甜州。目前被普遍认为有20个有效种，近60个基因型【12，131，20个种分别为犬隐孢子虫以c口，?叫、小鼠隐孢子虫孵朋”，矽、猪隐孢子虫似s“圳、猫隐孢子虫候尼，到、微小隐孢子虫解p口M州、火鸡隐孢子虫他所P彪孵耐矽、人隐孢子虫他肋掰历矽、安氏隐孢子虫fle口”出船D玎f)、巨蜥隐孢子虫f1G唧幻印D，-触“mva阳矽、莫氏隐孢子虫f1眵啊幻印Dr砌甜m所D胁甜砂、袋鼠隐孢子虫f1毋牌幻．印砒玩册朋伽嘲∞砌彬)、菱鲆隐孢子虫f1C叼伊幻妒D，-胁“朋sc印办砌口砌砂、贝氏隐孢子虫似6口f，I圳、蛇隐孢子虫flc，即fo印。尸胁z，聊se憎entis)、鸡隐孢子虫《c唧toSpo“dillmgaHi)、费氏隐孢子茧(C’^yptospo，^idillm，砂eri)、维瑞隐孢子虫伽幻印Dr油甜聊wM护f)、蜥蛇隐孢子虫f1G阳“唧厅f，”州、赖氏隐孢子虫弼哆少D印D，．砌”m，)朋”叫和牛隐孢子虫弼唧fD互印r枷甜m6Dv例，基因型主要有隐孢子虫兔基因型作M66啦”D卯砂、马基因型似办D瑚秽”D铆叫、臭鼬基因型酊s砌础舻胛D卯∥、花鼠基因型I似c办勿朋zf刀置护加巧墨理"、鹿基因型fle仰幻妒or砌“mcP删f”P舻胛D卸砂、猪基因型1I和人隐孢子虫猴基因型似幻所加括聊伽劬gP”D卯砂雌15j等。人兽共患的隐孢子虫有8个有效种和3个基因型，分别为猪隐孢子虫、猫隐孢子虫、犬隐孢子虫、鼠隐孢子虫、人隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫，以及微小隐孢子虫牛基因型、微小隐孢子虫的鹿基因型【16】和微小隐孢子虫猴基因型【17】。寄生于牛的隐孢子虫有4个有效虫种，分别为微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和赖氏隐孢子虫【博J。1．2病原形态卵囊呈椭圆形或卵圆形，直径4．6“m。成熟卵囊内包含有残留体和4个裸露的子孢子。残留体由颗粒状物和一空泡组成，子孢子呈月牙形。在改良抗酸染色标本中，卵囊为玫瑰红色，背景为蓝绿色，卵囊颜色与背景颜色反差很强，囊内子孢子形态多样，残留体为暗黑色颗粒状。 1．3生活史隐孢子虫的生活史的整个发育过程无需宿主转换，繁殖方式包括无性生殖(裂体增殖和孢子增殖)及有性生殖(配子生殖)，两种方式在同一宿主体内完成。虫体各发育期均在由宿主小肠上皮细胞膜与胞质问形成的纳虫空泡内进行【19，201。虫体在宿主体内的发育时期称为内生阶段。随宿主粪便排出的成熟卵囊为感染阶段。卵囊随宿主粪便排出体外后即具感染性，被人和易感动物吞食后，在消化液作用下，子孢子从囊内逸出，附着于肠上皮细胞并侵入细胞，在纳虫空泡内进行裂体增殖。滋养体经3次核分裂发育为I型裂殖体，成熟的I型裂殖体含8个裂殖子。成熟裂殖子释放后侵入其他上皮细胞，发育为第2代滋养体，再经2次核分裂发育为II型裂殖体【201。含4个裂殖子的成熟II型裂殖体释出的裂殖子，进一步发育为雌、雄配子体，二者结合后形成合子，开始孢子增殖。合子发育成卵囊，成熟的卵囊含4个裸露的子孢子。卵囊有薄壁和厚壁两种类型之分。只有一层单位膜的为薄壁卵囊，其囊内子孢子逸出后可直接侵入肠上皮细胞，进行裂体生殖，导致宿主白体内重复感染；厚壁卵囊在肠上皮细胞或肠腔内经孢子化，囊内形成4个子孢子后随宿主粪便排出体外。完成整个生活史约需5．1l天。2隐孢子虫检测方法研究状况目前隐孢子虫检测方法主要是依靠实验室手段检查并发现虫体，采用分子生物学检测虫体基因以及免疫学技术检测抗原或抗体等。近年来，国内外学者在探索隐孢子虫病的检测方法方面做了大量的工作，已建立了组织学，粪便学，免疫学和分子生物学等方法。2．1组织学检查隐孢子虫病诊断的组织学方法有组织切片和组织活检法。1980年Tzipori首先从人粪便中检测到隐孢子虫卵囊，从而开始了无创伤的诊断时代‘2¨。组织切片染色法是在动物死前或死后6小时之内取相应的组织器官，如小肠、呼吸道、泄殖腔和法氏囊等的组织块，按常规方法进行取材、固定、制成组织切片并进行HE染色，在光镜下可见嗜碱性虫体寄生于宿主黏膜上皮细胞表面的微绒毛层边缘，虫体呈圆形或椭圆形，大小约4-5岬。由于隐孢子虫的个体极小，用光镜观察不易辩认，所以常配合使用电镜观察加以确诊。 2．2粪便学检查通过对人和动物粪便进行处理后获得卵囊的检查方法。目前，隐孢子虫的粪便学检查方法主要有卵囊浓聚法和染色法。2．2．1卵囊浓聚法依收集原理不同分为浮聚法，沉淀法，梯度法，密度法等【22】。浮聚法是利用介质的比重高于卵囊，使卵囊浮聚于介质液的表面，如硫酸锌浮聚法、蔗糖液浮聚法、硫酸锌浮聚．耐酸漏斗滤过法、饱和盐水浮聚法等，其中最常用的是硫酸锌浮聚法和蔗糖浮聚法。沉淀法是依据卵囊的比重大于介质液时，卵囊可自然或经离心沉聚，方法有自然沉淀法、离心沉淀法、汞碘醛离心沉淀法、醛醚沉淀法、水醚沉淀法、福尔马林．乙酸乙酯沉淀法及其改良法、乙醚．次氯酸钠法等，其中应用最广泛的是福尔马林．乙酸乙酯沉淀法。梯度法是以不同比重的溶液顺序排列作为离心介质，卵囊离心时聚集于与其比重相当的介质层之间，主要有蔗糖梯度法、Percoll梯度法和氯化铯梯度法，后两种方法收集的卵囊均为无菌卵囊，可用于动物感染和免疫学研究【22I。密度法的原理同梯度法相似，使用两种介质液，卵囊位于二者交界面，根据所使用的介质不同可分为蔗糖密度法和淋巴细胞分离液法，后者较少使用。国内很多学者对浓聚隐孢子虫卵囊的方法进行了筛选。2006年，朱民等123J对饱和氯化钠漂浮法、Sheather’s蔗糖漂浮法、甲醛．乙醚沉淀法、不连续蔗糖密度梯度离心法和Percoll密度梯度离心法做了比较和讨论，得出：密度梯度离心法的效果优于漂浮法，而漂浮法效果较沉淀法好，因此，不连续蔗糖密度梯度离心法可能是目前较公认的一种经济、有效的卵囊分离纯化法，而且纯化的卵囊不仅数量多，杂质较少，适用于免疫学研究。同年，陈甫和黄克和【24】初步建立了用改良饱和盐水漂浮法与CsCl密度梯度离心法相结合的方法分离纯化微小隐孢子虫卵囊，此方法相对比较简单，获得的卵囊适合于隐孢子虫的体外培养和病原学研究。黄克和【25】等通过实验将饱和盐水漂浮法和蔗糖密度梯度离心法进行比较，发现两种方法得到的卵囊回收率和纯度并无明显差异，并且卵囊短时间接触饱和盐水并不影响其发育。王妍等B6】通过实验对饱和硫酸锌漂浮法、蔗糖密度梯度离心法和饱和盐水漂浮法进行比较得到：饱和硫酸锌漂浮法检查隐孢子虫卵囊，检出率最高、卵囊纯度好、效果最佳。2．2．2染色法由于隐孢子虫卵囊很小，直接镜检常难以分辨，而染色后分辨率明显提高。隐孢子虫检测常用的染色法有沙黄一美蓝染色、金胺．酚染色法、改良抗酸染色法、金胺一酚改良抗酸复染法、Trichrome抗酸染色。Henricksen等(1981)报道，用改良Zeihl．Neelsen抗酸染色法对粪便涂片染色后，在显微镜下观察卵囊进行诊断，其对比性很强，观察时比较容易区别，这一方法已被广泛应用。韩范介绍金胺一酚染色法，4 该法可用于新鲜粪便的染色，染色后的标本在荧光显微镜低倍下卵囊为一圆形小亮点，光滑致密，发出乳白色荧光；高倍镜下卵囊乳白或略带绿色的荧光，多数卵囊周围深染，中央淡染，似环状。1990年，韩范等将以上2种方法结合起来，即先用金胺．酚染色，再用改良抗酸染液进行复染，可使着色卵囊和非特异性着色颗粒区分开来，隐孢子虫卵囊的检出率和准确性有了很大提高。而陈甫和黄克和【271用MAFs法【28】检测隐孢子虫卵囊的最低域值为109鼠粪中2×104个卵囊，敏感性同IFA．McAb法，而且此法经济，简单，快速。曹建平掣29】通过对金胺．酚染色法、碘液染色法、吉氏染色法、改良抗酸染色法和金胺．酚改良抗酸复染法进行对比实验认为为了获得快速、准确的诊断。2．3免疫学检测血清学方法是检测人和动物是否感染隐孢子虫的重要方法之一【3Ⅲ，近年来，国内外已建立了多种对隐孢子虫病的免疫学检测方法，这些方法特异性强，灵敏度高，稳定性好，且操作简单易于掌握，是传统病原学方法和组织学方法无法比拟的。隐孢子虫血清学检测方法要获取隐孢子虫卵囊抗原，首先要分离和纯化卵囊，纯化的卵囊再经C射线或超声粉碎，制成抗原悬液。免疫学检测方法很多，主要有酶联免疫吸附试验(enZymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)、免疫荧光试验(immunonuorescenceantibody，IFA)、蛋白印迹技术(Westemblotting)、免疫酶染色技术(IESD、酶联免疫印迹技术(enzyme—linkedimmunoblottingtechnique，ELIB)、单克隆抗体检测技术(McAb)、流式细胞术(FCM)和电化学发光检测技术(electro．chemiluminescenceassays)等。这些技术主要是用于检测特异性IgM、IgG、IgA抗体或检测隐孢子虫卵囊抗原。2．3．1酶联免疫吸附试验伍LISA)酶联免疫吸附实验检测隐孢子虫有很多优点，比如其特异性、敏感性和稳定性都较高，且操作简单、易于掌握，适用于隐孢子虫病的检测、诊断和流行病学调查，已广泛应用于隐孢子虫的临床诊断。用ELISA方法检测隐孢子虫时，是以卵囊做固相抗原，以检测血清抗体IgG、IgM。Laxer等用ELISA方法检测病人粪便、血清和十二指肠液中抗隐孢子虫特异性的IgM、IgG和IgA的变化情况，结果发现急性期血清中IgG、IgA和IgM以及粪便中IgM、IgG均明显升高，十二指肠液体中IgA在第6周时明显升高。黄克和等【3I】于1999年应用间接ELISA法检测动物血清中抗隐孢子虫抗体，发现其特异性和敏感性均较好。尹继刚等于2000年采用抗微小隐孢子虫单克隆抗体2C3进行双抗夹心ELISA反应，结果并未见与球虫和结肠小袋纤毛虫发生交叉反应，表明该隐孢子虫单克隆抗体的特异性较好。2．3．2免疫荧光试验(IFA)免疫荧光试验分为直接免疫荧光试验和间接免疫荧光试验，其原理都是抗原、抗 体特异性结合并发生免疫学反应后，在荧光素的荧光作用下通过显色来直观鉴定隐孢子虫的存在。免疫荧光法检测隐孢子虫卵囊的标准是：(1)在用新鲜卵囊做对照时至少能检出50％；(2)能看到围绕卵囊壁的特殊荧光；(3)能看到直径4．6um的圆形或近圆形荧光外形；(4)偶尔可见卵囊壁的折叠。Tlladdeus等于1996年分别用直接和间接免疫荧光法检测隐孢子虫，从检出率看，2种方法的敏感性均为100％，而且隐孢子虫的不同种用这2种方法检测具有相似的敏感性和特异性。1996年EPA提出检测隐孢子虫的免疫荧光试验法称为1622法。Rusnak等用间接免疫荧光法与改良抗酸染色对照检查了119份隐孢子虫感染病人的粪便，结果均为阳性，IFA的敏感性为100％，在63份染色阴性粪便中，IFA检测61份阴性，特异性为97％。免疫荧光试验(IFA)检测隐孢子虫灵敏度和特异性都很好，尤其对于无症状带虫者及排卵囊量极少的患病者也有很好的检测效果。但是免疫荧光试验所需试剂价格昂贵、荧光容易衰退、试验过程耗时长，且必须配备专门的荧光显微镜，在很大程度上限制了该技术的广泛应用。2．3．3单克隆抗体检测技术(McAb)近年来，单克隆抗体检测技术已开始应用于隐孢子虫的检测和隐孢子虫病的诊断。用单克隆抗体技术还可鉴定子孢子膜上的多肽、对虫体抗原成分进行分析以及虫种的鉴定。1990年Robert等研制出抗微小隐孢子虫卵囊的单克隆抗体，并将其用于隐孢子虫病的诊断。目前，国外成功研制由抗隐孢子虫卵囊及子孢子的单抗制成的免疫荧光试剂盒。国内张西臣等也报道有关于制备隐孢子虫单克隆抗体的研究，其于1991年经克隆筛选，最终建立了5个抗微小隐孢子虫的单克隆抗体株，分别为1A8、282、3C4、lA3和2C3。单克隆抗体检测法具有较高的特异性，敏感性达到改良抗酸染色法的10倍以上。2．4分子生物学检测随着分子生物学技术的突飞猛进，又由于分子生物学技术具有简便、快速、准确、敏感性高和特异性强等优点，因此此方法已经在隐孢子虫检测中得到广泛应用。2．4．1PCR方法1991年La)(er克隆出C．p口n，zl所的一个2．3Kb的DNA片段，进行了序列分析，并选择其中452bp片段作为靶序列，设计并合成了1对26个碱基的引物，这是首次将PCR方法应用于隐孢子虫病研究中。PCR方法的建立是分子生物学发展史上的一次革命，已成为分子生物学领域最常用的方法之一；该方法使在体外从微量模板DNA合成大量特异DNA成为现实，PcR技术检测人和动物粪便中的隐孢予虫，敏感性比目前常用的检测方法约高100倍。与其他方法比较，PCR比ELISA至少敏感100倍，比IFA敏感50一5006 倍，比抗酸染色法及免疫荧光染色法高约5000倍，可极大提高携带者和慢性少量排卵囊患者的检出率；PCR对隐抱子虫卵囊的最低检测阐值为1．100ngDNA或10．500个卵囊儋，该技术与杂交技术联合应用，可检测出0．1pg的DNA，相当于1个卵囊水平，使其检测敏感性与特异性均达100％。Cai用PCR克隆技术获得微小隐孢子虫和鼠隐孢子虫18SrRNA基因的完整序列，并进行核苷酸序列分析表明，C．历计函和C．阳w甜朋的18SrRNA基因序列一致性达到99％以上；将c．朋材r如和C．p口w"聊的18SrI埘A基因序列与Johnson报告的rI矾A部分序列比较，显示有92％．96％的同源性。Higgins等选择小核糖体rRNA中的一段835bp片段为靶序列，发现该序列属的特异性很高。国内马良从含微小隐孢子虫的粪便中也克隆出一段长为452bp的微小隐孢子虫特殊目的片段序列，该方法检测的阈值达500个／g粪便，比以前常规方法敏感高100倍。巢式PCR方法是根据隐孢子虫靶向扩增序列设计一对外源引物和一对内源引物，以外源引物进行初次PCR扩增，将所获得的产物作为第二次PCR模板用内源引物进行第二次PCR扩增，鉴定PCR产物。由于进行了两次PCR反应，该方法与PCR相比具有更高的灵敏性和特异性，并且对PCR反应时卵囊纯度的要求也没有常规PCR高。卵囊的纯化、模板DNA的制备和引物的设计是PCR方法进行隐孢子虫检测的三个最重要的环节。其中模板DNA的制备以前主要是参照La)(er的方法，即用蛋白酶K裂解纯化的卵囊，再用酚．氯仿法提纯DNA，并且DNA的回收率不高。李培英等[32】改进了DNA模板的制备方法，在含有TE和D1Tr的消化液中，利用冻融法裂解出虫体DNA，不经酚一氯仿法提纯即作为PCR模板，虽然其DNA不纯，但用于PcR的检测是可行的，并使PCR方法更加快速、简便。2．4．2PCIORFLP利用虫体DNA的种(株)特异性遗传标记，PCR．I冲LP可以区分种内及种间的差异。近年来，PCR．RFLP方法被广泛用于各种寄生虫的分类鉴定上。研究结果表明，在对隐孢子虫的鉴定上，不同序列研究的数据表明微小隐孢子虫的确含有明显不同的基因型【33I。xiao等取自80名秘鲁儿童的132份粪便样品进行隐孢子虫卵囊的检测，首先用PCR方法扩增隐孢子虫18SrI矾A基因片段，随后用限制性内切酶SspI和VspI消化PCR产物，并进行凝胶电泳分析，根据电泳条带差异鉴定出Cp删“历人基因型、牛基因型、狗基因型，C．朋P彪孵砌s，c：店凰【341。Leng等【351研究建立一种PCR．IULP方法，可以检测、区分Cp口wz，m，Cm"，厶和C6口以y正三种隐孢子虫。其方法是用PCR扩增18SrRNA基因中一段约1750bp长度的产物，再用限制性内切酶DraI和VspII双重消化，消化产生的不同大小片段通过电泳分析可以同时将三种虫体区分开来。本方法可以预测卵囊污染的环境样本的致病性，帮助确定卵囊污染来源【33】。应用分子生物学方法检测隐孢子虫除了PCR和PCR．I心LP外还有RAPD．PCR、I弭PCR以及生物芯片技术等。 3隐孢子虫鉴定方法研究进展早期隐孢子虫鉴定是根据卵囊形态学差异、宿主特异性和地理分布等进行分类。随着分子生物学技术的发展，PCR技术应用于隐孢子虫的检测，并结合序列分析可鉴别隐孢子虫的不同虫种、基因型或基因亚型，对隐孢子虫的分类学及分子流行病学具有重要意义【36j71。3．1形态学鉴定形态学鉴定是原虫分类的基础，通过比较虫体的形状、大小等，可以作为确立一个新的虫种时的重要参考依据。形态学方法操作技术容易掌握，检测成本低，目前该方法是鉴定隐孢子虫较为常用的方法。但由于不同种类的隐孢子虫卵囊大小相近、结构相似，所以根据卵囊形态鉴定隐孢子虫种进行分类学研究时，还应包括其它特征。3．2基因鉴定在发现隐孢子虫初期，多以发现的宿主来命名，后来通过动物交叉感染试验发现，许多隐孢子虫并不是只感染一种动物，如Cm甜，．西，Cp口w甜m，C聊P，鲴矿础加等，没有宿主的特异性，许多以宿主命名的种为无效种，这种命名原则也不再适用p引。再者隐孢子虫种类繁多，有些种内存在着大量基因型和基因亚型，仅凭形态学很难对其做出准确鉴定。分子鉴定法是根据隐孢子虫基因片段的特征或核苷酸序列的差异来确定虫种和基因型，能够有效弥补传统分类法和根据宿主命名的缺点和不足【39l。基因分型技术从遗传分子水平阐明隐孢子虫种系关系，其与形态鉴定、宿主特异性、生物学特征研究等的互补增加了分类鉴定的科学性和准确性。目前常用于鉴定隐孢子虫种类和基因型的基因序列有18S小亚单位核糖体IⅢA(SSUrRNA)、热休克蛋白基因(HsP70)、隐孢子虫卵囊壁基因(CoWP)、Cp口w甜m60．kDa糖蛋白基因(GP60)、易变异的内转录rDNA间隔子ITs．1和ITS．2、乙酰辅酶A合成酶(acetylCoA)基因、二氢叶酸还原酶一胸苷酸合成酶(dhfr-ts)基因【401、血小板反应蛋白．相关黏附蛋白(TRAP．C1和TRAP-C2)以及一些未鉴定功能的基因片段等也可用于隐孢子虫的种类鉴定。3．2．1SSUrRNA真核生物的核糖体DNA(rDINA)通常由小亚基rI必A(SmallsubunitR．bosomalIⅢA，SSurRNA)基因(如18S)和大亚基rRNA基因(如28S)串联而成。不同隐孢子虫种的18SrRNA基因序列信息已经被国内外广泛报道，为我们的研究工作提供了基础。Coupe等【411研究发现18SrIⅢA基因第179．271核苷酸序列之间有种问和亚种的特异性，因此它们适合限制性内切酶的切割。Leng等【35J用PCR方法扩增18SrRNA基因中 一段约1750bp长度的产物，再用限制性内切酶DraI和VspI双重消化，消化后产生的产物通过电泳分析不同片段的大小可以同时将c．朋耵括、Cp刃甜聊和C6口如vf3种隐孢子虫虫体区分开来。Ryan等通过对澳大利亚西部猪源隐孢子虫l8SrIⅢA基因序列分析，发现猪除感染cs甜括外，还感染一种不同于cs“括和c瑚州“聊牛基因型的新基因型【3引。此外，许多学者的研究证明18SrRNA基因在鉴定大多数种类的隐孢子虫中是十分有用的【421。国内的梁楠等[431用套式PCR扩增出12个隐孢子虫分离株的18SrI斟A，并用PCR．RFLP进行分析得出结果：12个奶牛源隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫《C．觚dersoni)o3．2．2HSP70基因HsP70基因属于多基因家族，作为分子伴侣辅助蛋白折叠和转运，在原核生物和真核生物的生物进化过程中具有高度保守性，同时还具有种内／种问鉴别位点，通过基因序列分析和I疆LP．PCR可准确的对不同基因型进行鉴别。Khramtsovetalm】首次扩增Cp删甜m基因型分离株HSP70基因序列，在此序列基础上开发出诊断环境样品中隐孢子虫的检测方法。Gobet等【45】利用PCR．I心LP技术分析了微小隐孢子虫的HsP70基因的587个碱基，能检测和区分Cp口n，甜m的两种基因型，并且能区分Cp口wzf朋的其它基因型和种类。Xiao【46】用小亚单位核糖体I矾A(sSrRNA)、热休克蛋白基因(HSP70)和肌动蛋白基因(Actin)的基因序列来构建系统发育进化树，并利用寄生部位将隐孢子虫分为2大类：一类是包括所有现己知道的寄生于胃的隐孢子虫，即C朋掰r西、C．口”虎坶D"i和C．sP佃聆加。另一类是所有寄生于肠的隐孢子虫，只是其中C．6口f厶秒f的位置略有不同，在SSrIⅢA和肌动蛋白中与肠寄生隐孢子虫为一类，而在HSP70中却与胃寄生隐孢子虫为一类。综上所述，基因分析技术用于隐孢子虫分类鉴定研究，可从遗传分子水平阐明该虫的种系发生关系，与传统的形态学方法相比有无可比拟的优越性，从而可以进行更精确的分类和分型。4隐孢子虫囊壁蛋白(CoWP)研究进展隐孢子虫生活史分为无性繁殖和有性繁殖两个阶段，在虫体离开宿主并侵染另一个宿主的过程中，其表面会形成坚实的被膜，被膜包裹着子孢子和残体等合称为卵囊，这层保护性的卵囊囊壁由蛋白和多糖等物质组成【471。虽然我们对隐孢子虫卵囊壁的形成过程还不是很清楚，但我们可以尝试通过干扰甚至阻碍囊壁的形成来制止虫体的进一步感染14引。鼠隐孢子虫和微小隐孢子虫卵囊壁中分别包含了16种蛋白质。隐孢子虫卵囊囊壁蛋白(cowP)是多基因家族成员，与弓形虫的cowP(TgOwPl)同源【49】。Lally等1992年从在体外脱囊的子孢子中提取基因组DNA，构建了入gtll表达文库，9 获得了一个2359bp的囊壁蛋白基因片段；Ranucci等学者于1993年以类似的方法筛选文库，也获得了一个编码1252个氨基酸序列的开放阅读框，研究发现它们都是编码190000的卵囊壁蛋白的部分基因。spano等学者1997年进一步克隆出cowP全长基因，该基因共编码1622个氨基酸，含有一段明显的信号肽，此段信号肽包含了2个富含半胱氨酸的模体，这2个模体互不相同但都有半胱氨酸周期出现的特征，是顶复门生物特有的模体，被命名为I型区和II型区【501。研究表明COWP聚集在成熟大配子的成壁小体并最终定位于卵囊壁的内层。4．1隐孢子虫囊壁蛋白与免疫逃避机制隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)是组成隐孢子虫虫体卵囊壁的主要成分，在虫体裂殖生殖的过程中，囊壁破裂是子孢子侵入细胞的关键过程；配子生殖末期，合子形成以后，囊壁逐渐形成，即为发育完全的卵囊；而在孢子生殖过程中，薄壁型卵囊在体内自行脱囊，造成宿主自体循环感染，厚壁型卵囊则随粪便等排出体外，造成个体间横向水平传播【5l】。可见，卵囊壁的形成与脱落参与了虫体的各个生殖阶段，同时也参与着宿主的免疫反应。虫体在宿主体内很大程度上的自我保护要靠卵囊壁。因此，对囊壁蛋白的研究有助于隐孢子虫的免疫逃避机制研究，也有望成为预防和治疗安氏隐孢子虫的靶位。4．2隐孢子虫囊壁蛋白用于基因鉴定COWP基因是隐孢子虫所特有的，在不同种类或不同基因型隐孢子虫之间该基因比较保守，其序列差异可用于隐孢子虫分类和基因分型研究【52】。Xiao【46J应用PcR研究微小隐孢子虫rc．p删甜m)和其它隐孢子虫虫种的COWP基因的多样性，结果表明COWP基因具有广泛的多态性，这种差异在找到特异性的引物情况下可以用来反映不同虫种问基因序列的差异性和区别部分虫种。Giangasperoetal删根据隐孢子虫CoWP基因设计引物，进行PCR反应，对意大利犬源隐孢子虫进行分子鉴定，结果表明在意大利狗中同时流行微小隐孢子虫似p以w甜圳和犬隐孢子虫衅c以门矽两种隐孢子虫。Xiao等【46】也发现基于3种不同隐孢子虫基因型的COWP基因设计引物进行PCR-RFLP反应时，也可以使鼠隐孢子虫孵朋甜r圳和蛇隐孢子虫他se畔，?f圳的CoWP基因得到扩增，这表明基于COWP设计的引物并不只是对微小隐孢子虫flepa，．”叫的COWP基因有特异性。国内刘海鹏等【521以隐孢子虫囊壁蛋白为虫种鉴定基因分子，设计并合成引物扩增出徐州牛源隐孢子虫卵囊囊壁蛋白(CoWP)基因，其序列与Genbank公布的安氏隐孢子虫cOwP基因序列同源性为99％，表明分离出的徐州牛源隐孢子虫为安氏隐孢子虫。10 4．3隐孢子虫囊壁蛋白与核酸疫苗研究进展隐孢子虫囊壁蛋白存在于隐孢子虫卵囊壁上，作为一种表面蛋白，其可以为隐孢子虫核酸疫苗的研制提供基因基础，随载体注射入人和动物机体诱导产生特异性抗体，为隐孢子虫的血清学诊断和免疫预防提供物质基础。4．3．1核酸疫苗研究进展核酸疫苗是一类新型疫苗，即将某种保护性抗原的编码基因克隆到真核细胞表达调控序列的质粒中，制成DNA重组质粒并接种至动物体内后，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到治疗和预防特异性疾病的目的。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究最多的是DNA疫苗。目前已研制出针对多种病原体的DNA疫苗，并在多种实验动物中取得了明显的效果。国外学者对使用核酸直接免疫的构想探索了很多年。在20世纪70年代末，M．A．Israel等将纯化的多瘤病毒DNA直接注射小鼠使其感染，首次证实裸DNA可被动物体细胞摄入并到达细胞核得以转录，这为核酸疫苗的研制打下坚实的基础。1986年，Benvensity等学者用标记有放射性同位素的DNA直接注射入新生大鼠体内来研究DNA在不同组织中的吸收、分布和表达情况。结果发现，DNA在各组织中分布有所不同，其中肠、肝、脾等组织内含量较高，注射后动物体内的DNA既分布于肝细胞外也分布于肝细胞内。1990年Wblfr等首次报道了向小鼠肌内注射质粒DNA，质粒及其携带的基因可被肌细胞所摄取并表达。1992年Rabimovich等人将编码某种抗原的基因片段与载体质粒连接所构成的重组质粒称为核酸疫苗，核酸疫苗注射入机体内后，外源抗原蛋白可被持久表达并可刺激机体产生免疫应答。在寄生虫领域，国外已有人对疟疾、利什曼原虫病、血吸虫病【54】病原的核酸疫苗己经或正在进行研究，而国内则处于起步阶段。总之，与细菌、病毒等核酸疫苗的研究一样，寄生虫核酸疫苗的研究也已成为日前研究的热点之一。4．3．2隐孢子虫核酸疫苗研究进展与细菌、病毒等微生物相比，寄生虫具有较复杂的生活史，因此尽管隐孢子虫是原虫，但是想要研制出其有效的核酸疫苗并彻底治愈隐孢子虫病仍然是很困难的。目前寄生虫疫苗的研制还面临着许多困难。首先，隐孢子虫的生活史存在多个发育阶段，从寄生虫的抗原成分来看，隐孢子虫的发育分为三个时期，即卵囊期、胞外发育期和胞内发育期，这三个不同时期有不同的抗原成分，诱导不同的免疫反应发生，给疫苗研制带来一定的困难；其次，隐孢子虫宿主种类繁多，存在着宿主特异性。目前已知的隐孢子虫宿主包括鱼类、爬行类、鸟类、哺乳类等5大类接近200种动物，这为理想的感染动物模型建立提出一个重要的问题：第三，公认的隐孢子虫体外培养方法尚 未确立；第四，隐孢子虫的生物学特征和引起免疫反应的机理还没有完全清楚，这四点无疑都影响隐孢子虫核酸疫苗的研制进程。随着分子生物学、细胞生物学和分子免疫学、细胞免疫学等技术的发展，各类疫苗的研究技术已经成熟，但目前仍没有疫苗可用来有效预防隐孢子虫病。前人对隐孢予虫病的预防进行了一些探索，如采用牛或绵羊的高免初乳或高免血清预防隐孢子虫病有一定的效果；Harp等1996年用冻干的隐孢子虫卵囊作免疫原对牛进行免疫获得了部分保护，但是这些方法需要的成本很高，很难得到广泛应用。因此研究隐孢子虫疫苗已迫在眉睫。能作为隐孢子虫核酸疫苗的基因分为7类：细胞骨架成分、核蛋白酶、RNA翻译因子、热休克蛋白、囊壁成分和表面抗原与微线抗原，这些抗原主要集中在子孢子蛋白、卵囊壁蛋白、细胞骨架蛋白、热休克蛋白和微线蛋白。子孢子表面抗原有gpl5、gp23、gp40、氨甲酰基磷酸合成酶-500(CPS一500)和环子孢子样糖蛋白外抗原(CSL)等，微线蛋白有糖蛋白gp900、隐孢子虫一l血凝素相关粘附蛋白(耵认P．C1)、子孢子富半胱氨酸蛋白(SCRP)以及囊壁蛋白(COWP)和热休克蛋白(HSP)等。在上述7类基因中，囊壁蛋白作为隐孢子虫的囊壁成分，形成于隐孢子虫的配子体期和卵囊期，是研制隐孢子虫核酸疫苗的重要基因之一。由于隐孢子虫病的治疗是全球尚未攻克的难题，目前所用药物均难以达到很好的效果，核酸疫苗的研制便成为防控隐孢子虫病的突破口，因此，隐孢子虫核酸疫苗的研究已受到国内外学者们的关注。研究者曾用隐孢子虫卵囊壁蛋白CPl5、CP23、CPl5／60等作为研究核酸疫苗候选基因的靶基因，也有学者对隐孢子虫囊壁蛋白(COWP)基因进行克隆重组，转入动物体内表达，检测重组蛋白存在一定的抗原性。这些分子有可能成为未来药物治疗隐孢子虫病的靶标，对研制抗隐孢子虫病疫苗也具有十分重要的意义。5结语隐孢子虫寄生于人和多种动物体内引起多种症状，尤其在儿童、免疫力低下者及艾滋病患者更是显示出严重的危害。其因感染率高、感染范围广、危害严重而逐渐受到人们的重视。近年来，国内外学者对隐孢子虫的病原、生活史、虫种鉴定和免疫学等方面做了大量的研究，并取得了显著的成绩。研究表明，虫体经过裂殖生殖和孢子生殖的繁殖方式在寄生宿主体内和自然环境中进行发育繁殖，在这个过程中引起宿主发生消化道粘膜、呼吸道粘膜以及内脏器官等的病理变化。在隐孢子虫虫种鉴定方面，虽然已经确定隐孢子虫有20个种，60多个基因型，但目前隐孢子虫的种类和分型仍呈现出混乱状态，仍有很多学者对隐孢子虫的虫种鉴定存在争议，因此研究建立更简便、更准确的隐孢子虫分子鉴定方法已迫在眉睫。另一方面，由于隐孢子虫宿主的众多、 感染的复杂性，且人们尚未摸清隐孢子虫病的致病机制，导致至今仍未有有效治疗隐孢子虫病的药物，而当今核酸疫苗研制技术已日渐成熟，前景非常广阔。因此，从隐孢子虫病的免疫预防突破，寻找合适的靶位，研制出隐孢子虫特异性核酸疫苗，是今后有效控制隐孢子虫病的重要举措之一。相信随着分子生物学技术以及核酸疫苗技术的发展，隐孢子虫虫种鉴定和免疫预防定会取得突破性进展。 引言隐孢子虫病是由隐孢子虫(蛳．鞋，D，．砌甜m)感染引起的一种呈世界性分布的人畜共患寄生虫病【551。隐孢子虫寄生于人和多种动物的消化道和呼吸道上皮细胞，已成为人类6种常见腹泻病的病原之一，也是艾滋病患者的诊断指标之一【1’2】。1971年美国Pancier等首次报道犊牛隐孢子虫病，1976年由Nime和Meisel首先报道人的隐孢子虫病【101，继之英国、澳大利亚和加拿大等国先后报道该病，并认为隐孢子虫是引起犊牛腹泻的主要病因之一【431。我国自1986年陈义民等在兰州首次报道牛感染隐孢子虫病以来，随后在全国范围内展开了隐孢子虫感染情况的调查。目前公认在众多的动物中，牛是人类隐孢子虫病最重要的传染源【561。近年来，国内外对隐孢子虫病进行了较广泛而深入的研究，在病原学、流行病学、诊断及综合防控等方面取得了一些重要成果。但以往关于隐孢子虫种类鉴定的多数资料仅基于传统的卵囊形态学观察【571，由于隐孢子虫宿主的多样性，种类繁多，各种隐孢子虫卵囊的形态和大小差异较小，仅凭形态学很难对其做出准确的鉴定。根据隐孢子虫基因片段的特征或核苷酸序列的差异来确定虫种和基因型能够有效弥补传统形态学方法的不足。目前国内关于隐孢子虫分子鉴定的资料较少，合肥地区尚未见奶牛源隐孢子虫分子鉴定的报道，因此，分离合肥地区奶牛源隐孢子虫，并对其进行分子鉴定具有重要意义。在隐孢子虫病的治疗方面，虽然国内外学者先后使用200多种药物进行治疗试验，但至今仍未见公认有效的治疗隐孢子虫病药物的报道。随着分子生物学和免疫学等技术的发展，疫苗的研制技术已经成熟，人们期望研制出预防隐孢子虫病的疫苗，使免疫预防隐孢子虫病成为可能。寻找和克隆特异性抗原候选分子可为隐孢子虫疫苗的研制提供材料。基于上述，本课题拟(1)采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对合肥地区某奶牛场奶牛隐孢子虫感染情况进行检测，从阳性奶牛粪样中分离和纯化隐孢子虫卵囊；(2)对所获隐孢子虫卵囊进行形态学和分子鉴定；(3)克隆隐孢子虫囊壁蛋白基因。14 1材料与方法1．1试剂1．1．1单蒸水单蒸水自制1．1．2饱和蔗糖溶液蔗糖0．5奴苯酚6．7ml蒸馏水0．32LPBS(pH8．O，O．0lmol／L)：NaCl8．Og，NaH2P041．159，KCl0．29，K2口040．29，加蒸馏水至1L。1：2蔗糖溶液：饱和蔗糖溶液与2倍体积的PBS液混合。1．1．3改良抗酸染色液改良抗酸染色液I：苯酚8m1，95％乙醇20ml，碱性复红4g，dH20100ml；改良抗酸染色液II：浓硫酸lOml，dH2090ml；改良抗酸染色液IⅡ：孑L雀绿29，dH20100ml。1．1．4卵囊裂解液贮存液：1mol／LTris-HCl(PH8．0)，0．5mol／LEDl、A(PH8．0)，lO％SDS。工作液：10mmol／LTris-HCl(PH8．0)，O．1mol／LEDTA(PH8．0)，0．5％SDS。1．1．5粪便基因组DNA提取试剂盒美国Omega公司。1．1．6粪便基因组I斟A提取试剂盒美国Omega公司，R6828．01。1．1．7胶回收试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司，SK8131。1．1．8PCR扩增相关试剂引物：上海生工生物工程技术服务有限公司。根据严若峰例设计的隐孢子虫18SrRNA序列PCR扩增引物：Sl：5’一GGGTTG11ATT11A1vrAGATAAAGAAC一3’A1：5’-CTTTAAGCACTCTAAT，ITTCTC一3’：巢式PCR扩增引物：S2：5’．AAATAACAA，I’ACAGGGCCTAACG．3’A2：57一CAAAGTAAAGTT丁CCTI≮n蜘?ATlll’AGAA一3’：15 根据Mo曜an【59】设计的隐孢子虫HSP70序列PCR扩增引物：S3：5’一GGTGGTGGTACTI’TTGATGTATC．3’A3：5’一GCCTGAACCTrrGGAATACG-3’：巢式PCR扩增引物：S4：5．GCTGSTG』蛔rACTCACTTGGGTGG一37A4：5’-CTCTTGTCCATACCAGCATCC一3’：根据安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因(GeneBank登录号：DQ989570)设计1对PCR扩增引物：S5：5’．TGGAAGAGArTGTGTAGCGll]r_37A5：5’．TACTGGTTGTGTTGATGCGGTG．3’。Taq酶：上海生工生物工程技术服务有限公司，5U／斗l。4种dNTPMixture：批号D4030A，TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。电泳试剂：50×TAE：Tris2429，0．5mmol／LEDTA(pH8．0)100ml，冰醋酸57．1ml，定容至1L；1×TAE，稀释自50×TAE。溴化乙锭(EB)：批号E0492，上海生工生物工程技术服务有限公司。琼脂糖：西班牙琼脂糖(Biowest)，111860。1％琼脂糖凝胶的制各：1×TAE99ml，琼脂糖lg，于电炉上熔化后加溴化乙锭(EB)5}Ll，配成1％琼脂糖凝胶。DNAMarker：DL2000，批号GM335，上海生工生物工程技术服务有限公司；DNAMarkerV，批号MDl05．01，天根生化科技(北京)有限公司。1．1．9反转录试剂盒AH301．02，北京全式金生物技术有限公司。1．1．10克隆相关试剂感受态细菌制备试剂盒购于上海生工生物工程技术服务有限公司。培养基：LB培养基、琼脂粉、氨苄青霉素购于上海生工生物工程技术服务有限公司。LB液体培养基取259LB培养基溶解于1000ml蒸馏水中，充分溶解后分装成每管4ml，高压灭菌，4℃保存待用。使用前每管加入4ul氨苄青霉素。LB固体培养基取259LB培养基和159琼脂粉溶解于1000ml蒸馏水中，高压灭菌，待温度将至50℃后，加入氨苄青霉素钠溶液1m1(氨苄青霉素终浓度为loo肛g／mJ)，摇匀并倒板，凝固后标记置于37℃过夜，观察平板，未被污染的平板用封口胶封边，并倒置放于4℃保存待用。克隆载体：pMDl9．Tsimple，TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司。16 1．2主要仪器1．2．1PCR仪Bio．Rad美国伯乐有限公司。1．2．2恒温培养振荡器ZHwY-103B，上海智城分析仪器制造有限公司。1．2．3电泳仪DYV6C，北京六一仪器厂。1．2．4手掌型离心机Lx．100，江苏海门市其林贝儿仪器制造有限公司。1．2．5双目生物显微镜NikonYS2，南京江南光电股份有限公司。1．2．6高速冷冻离心机2K．15，珠海黑马科技有限公司。1．2．74℃冰箱BCD．195WN美菱数字节能王，合肥美菱股份有限公司。1．2．8旋涡振荡器QL．901，江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司。1．2．9水浴锅删．s8数字显示水浴锅，江苏金坛医疗仪器厂。1．2．10凝胶成像系统上海培清科技有限公司。1．2．1l压力蒸汽灭菌器SYQ．DSX．280，上海申安医疗器械厂。1．2．12电子天平A1604S，上海天平仪器厂。1．2．13漩涡混匀器QL．90l，江苏海门市麒麟医用仪器厂。1．2．14低速离心机LD4．2A，北京医用离心机厂。1．2．15恒温培养箱KW．I型，南京电气三厂制造。1．2．16．20℃冰箱海尔，青岛海尔有限公司。1．2．17超净台苏州设备进化有限公司。1．2．18电泳槽DYP．6C，北京六一仪器厂。1．3病原学方法检测奶牛粪样中隐孢子虫1．3．1粪样的采集在安徽省选某奶牛场作为调研点，从此奶牛场随机抽取285头奶牛作为调查对象，对待检奶牛逐头登记牛号、年龄、膘情及粪便外观等。从每头牛的直肠掏取新鲜粪便509，放入塑料袋内，置于4℃冰箱中保存待检。1．3．2虫体的检查对每个粪样均进行饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法处理。将509粪样置于烧杯中，加水，搅拌均匀，经40目铜筛和260目尼龙筛兜过滤，滤液收集于锥形量杯中，静置1h，倾去上清液，将沉渣加入离心管中，配平后3000rpm离心15min，弃去上清液，留管底粪渣。分别用以下2种方法进行检查：(1)饱和蔗糖溶液漂浮法在含有粪渣的离心管中加饱和蔗糖溶液，搅动管底沉渣，配平后3000rpm离心15min，粪渣下沉，卵囊漂浮于表层。用自制的铁丝环(FO．7cm)蘸取液膜，在400倍光学显微镜下观察卵囊形态，并在l000倍下测量卵囊大小。 (2)改良抗酸染色法从离心管底取少许粪渣(含少量水分)置载玻片上，涂成1角硬币大小的粪膜，晾干后用甲醇固定至粪膜干燥一染色液I染色8min_水洗一染色液II染色5min_水洗一染色液III染色lmin_水洗_晾干，在400倍光学显微镜下检查卵囊，在1000倍油镜下观察并测量卵囊大小。1．4隐孢子虫的分子鉴定1．4．1隐孢子虫卵囊的分离与纯化将采集的阳性奶牛粪样，加水，搅拌均匀，经40目铜筛和260目尼龙筛兜过滤，滤液收集于锥形量杯中，静置1h，倾去上清液，将沉渣加入离心管中，配平后3000印m离心15min，弃去上清液，留管底粪渣。将所获沉淀物等分成4份，置于4个离心管中，以蔗糖密度梯度离心纯化法，对隐孢子虫卵囊进行纯化。蔗糖密度梯度离心纯化法将上述沉淀样品加入离心管中，3000rpm，离心15min，弃上清。沉淀加1：2糖液，3000rpm，离心15min，保留上清。上清加水，3000rpm，离心15min，收集管底卵囊。将收集的卵囊加入装有1：2糖液的离心管中，3000rpm，离心40min，吸取交界处白色卵囊层，用蒸馏水洗涤3次，沉淀加入等体积的5％K2C向4，4℃保存备用。1．4．2隐孢子虫的DNA抽提将重铬酸钾中保存的卵囊沉淀用PBS洗3次，在沉淀中加入500ul卵囊裂解液、适量小玻璃珠，在漩涡混合器上震荡30min，后按照基因组DNA提取试剂盒的步骤进行DNA抽提。1．4．3隐孢子虫18SrRNA基因的扩增PCR反应体系为：试剂体积(¨1)ddH2012．510×PCR缓冲液2．54×dNTPs(各2．5mmoI／L)1上下游引物(50¨mol／L)2Taq酶(1u／“1)0．5模板DNA5丛g￡121：三总体积25将上述反应体系低速离心数秒钟后，进行PCR扩增反应。循环条件为94℃5min，然后94℃45s，55℃30s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延长10min。 巢式PCR反应体系为：试剂体积(川)ddH2016．5lO×PCR缓冲液2．54×dNTPs(各2．5mmol／L)l上下游引物(50叩10l／L)2Taq酶(1u／山)O．5模板DNA1丛蝗121：!总体积25将上述反应体系低速离心数秒钟后，进行PCR扩增反应。循环条件为94℃5min，然后94℃45s，55℃30s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延长10min。1．4．4隐孢子虫HSP70基因的扩增PCR反应体系为：试剂体积(山)ddH2012．510×PCR缓冲液2．54×dNTPs(各2．5mmol／L)1上下游引物(50岬oI／L)2Taq酶(1u／U1)0．5模板DNA5MgCl21．5总体积25将上述反应体系低速离心数秒钟后，进行PcR扩增反应。循环条件为94℃5min，然后94℃45s，55℃30s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延长10min。19 巢式PCR反应体系为：试剂ddH2010×PCR缓冲液4×dNTPs(各2．5mmoI／L)上下游引物(50岬ol／L)Taq酶(1u／p1)模板DNA体积(“1)16．52．5l20．5l丛99121：主总体积25将上述反应体系低速离心数秒钟后，进行PCR扩增反应。循环条件为94℃5min，然后94℃45s，55℃30s，72℃45s，进行30个循环，最后72℃延长lOmin。1．4．5扩增产物检测取扩增产物5肛l，与1斗l上样缓冲液混匀，于1％琼脂糖凝胶(含0．5肛∥mlEB)中电泳，电压4．5V／cm。电泳完毕，凝胶成像系统下观察，照相。1．4．6感受态细菌的制备将菌液于LB平板上四区划线后37℃培养过夜，挑取单菌落之后按照感受态细菌制备试剂盒的操作说明制备感受态细胞，以每管100山分装于1．5mL离心管中，于．80℃保存。1．4．7胶回收分别取18SrIⅢA巢式PCR反应的扩增产物和HSP70巢式PCR反应的扩增产物80ul于0．8％琼脂糖凝胶(含O．5¨g／mlEB)中电泳，电压4．5V／cm。电泳完毕，于紫外灯下用洁净手术刀片对目的片段进行切胶，称重，用胶回收试剂盒进行DNA回收。1．4．8目的基因的连接与重组质粒的转化胶回收产物与克隆载体连接，反应体系为：试剂胶回收产物克隆载体solutionIddH20体积(u1)3151总体积10将上述反应体系置于16℃水浴连接30min，全量(10u1)加入至100ul感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃热激45秒钟后，再在冰中放置1min。加入890ulLB液体培养基20 (不含氨苄青霉素)，37℃振荡培养60min。5000rpm离心3min，弃去上清培养基，留管底细菌，加入100ulLB液体培养基(不含氨苄青霉素)重悬，均匀涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，倒置放于37℃培养18h。待长出圆形有光泽直径约l-2mm的大肠杆菌菌落后，用接种环无菌挑取菌落接种于4ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养8h。1．4．9P深鉴定重组质粒取振荡培养8h后培养液混浊的菌液2mL作为PCR模板，进行PCR反应，25uL反应体系如下：试剂体积(“1)ddH2015．510×PCR缓冲液2．54×dNTPs(各2．5mmol／L)1上下游引物(50岬ol／L)2Taq酶(1u／pI)O．5模板DNA2丛匹!!!：!总体积25循环条件同所上述对应的目的基因PCR反应的循环条件。1．4．10测序鉴定取2mLPCR反应为阳性的重组大肠杆菌菌液于离心管中，送予上海生工生物工程有限公司进行测序。1．4．1l序列分析和进化树绘制(1)5个隐孢子虫分离株18SrI悄A巢式PCR扩增产物序列及自GenBank下载的其它相关隐孢子虫基因型部分18SrRNA序列如下：NO．1HFlaNO．2HF2aNO．3HF3aNO．4HF4aNO．5HF5aNo．6微小隐孢子虫猪基因型Cp惦w甜所p谵genotypeAFl08861No．7安氏隐孢子虫C口门沈坩D，?fAY954887No．8微小隐孢子虫Cp口w“mAFl08864NO．9贝氏隐孢子虫C6口池yfAF0934952l No．10维氏隐孢子虫CM，阳护fAFll5378NO．11火鸡隐孢子虫c-聊P尼呼挑AFll2574NO．12安氏隐孢子虫C口砒瑚"fAY881992N0．13鼠隐孢子虫鼠基因型Cm咿括mousegenotypeAF093498NO．14猫隐孢子虫C．力胁AFl08862No．15微小隐孢子虫C朋wzf埘AFll2569No．16安氏隐孢子虫C订玎如啪刀fDQ989573NO．17蛇隐孢子虫CsP馏P”廊AF093499NO．18隐孢子虫鼠基因型C卯幻印Dr油姗z印．mousegenotypeAF108863(2)5个隐孢子虫分离株HSP70巢式PCR扩增产物序列及自GenBank下载的其它相关隐孢子虫基因型部分HSP70序列如下：No．1HFlbN0．2HF2bNo．3HF3bNO．4HF4bNO．5HF5bNO．6维氏隐孢子虫Cw朋劳i彳门2J『贸No．7安氏隐孢子虫Ca砒坩D刀fDQ989576No．8安氏隐孢子虫e口刀如邶D刀fAY881992NO．9微小隐孢子虫Cp删“mAF221530NO．10牛隐孢子虫C．6Dv括AJ310881N0．11火鸡隐孢子虫C聊P昆锣溉AF221537NO．12人隐孢子虫C办D研加括AF401505No．13猫隐孢子虫C居凰AF221538No．14蛇隐孢子虫CJPpP刀船AF221541No．15贝氏隐孢子虫e6口以yfAF221539NO．16微小隐孢子虫鼠基因型C．p口w甜聊mousegenotypeAF221530N0．17安氏隐孢子虫C口砒糟D玎fAY954892NO．18鼠隐孢子虫Cm甜r如AF221543(3)序列同源性分析和进化树构建采用DNAstar软件对巢式PCR产物检测为阳性的分离株基因序列进行同源性分析，并采用DNAStar软件中的MegAlign程序中的ClustalVmethod构建系统进化树。 1．5隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆1．5．1隐孢子虫总IⅢA抽提采集新鲜奶牛源隐孢子虫阳性粪样，分离纯化隐孢子虫卵囊，参照1．4．2的方法并加入20ul巯基乙醇进行卵囊的破碎，然后按照IⅢA提取试剂盒的步骤进行I斟A抽取。1．5．2Rr-PCR反应RT-PCR反应体系为：试剂体积TotalRNA50ng-5ugOligo(dT)1¨l2×TSIIReactionMix10ulThnscriptIIMix1“l加dd水至20ul总体积20ulRT-PCR循环条件为：50℃30min，85℃5min。1．5．3PCR反应扩增隐孢子虫囊壁蛋白基因PCR反应体系为：试剂体积(肛1)ddH2015．510×PCR缓冲液2．54×dNTPs(各2．5mmol／L)l上下游引物(50肛mol／L)2Taq酶(1u／p1)O．5反转录cDNA2MgCl21．5总体积25将上述反应体系低速离心数秒钟后，进行PCR扩增反应。循环条件为94℃5min，然后94℃35s，53℃30s，72℃50s，进行35个循环，最后72℃延长10min。1．5．4囊壁蛋白基因的克隆将PCR扩增所得到的CoWP基因片段进行胶回收，连接pMDl9．T载体，导入感受态细胞。取2mLPCR反应阳性的重组大肠杆菌菌液于离心管中，送予上海生工生物工程有限公司进行测序。 1．5．5囊壁蛋白基因的序列比对将克隆所得到的COWP基因片段(命名为CoWP．耶)序列与自GenBank下载的安氏隐孢子虫囊壁蛋白(登录号DQ989570)在NCBI网站进行Blast比对。24 2结果与分析2．1奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定2．1．1隐孢子虫检测结果本次共检测合肥地区某奶牛场成年母牛粪样285份，隐孢子虫检测结果见表2．1。表2．1奶牛隐孢子虫感染率Table2-lC，即fD!pDr油蜊iIlfbctiverateofcows。j：⋯，、篓i掣攀警I。≥11ii鬻黪爹一．，∥≥。‘¨1“：熬i卷，_一，。}一。”。}i参一磐、一。j滋o≈，i『|)i添豢鎏≯‘，。?÷：萋奢警一墓“。囊纛妻芝≤”’⋯i篓蘩；囊纂气煮*2“。建黪gg擎o√‘?：it。謦≮喾豢-。_1’囊L+oo。謦4皆鼍?。∥。‘Fig．2一l00cystsof(乃伊fo置PD厂衙甜脚f如mcowofHefci(Saturatedsucrosefloation，×400) 用改良抗酸染色法从奶牛粪样中检出的卵囊为椭圆形或卵圆形(见图2—2)，呈玫瑰红色(染色背景为蓝绿色)，内部结构明显，着色稍淡，在1000倍油镜下观察，卵囊壁薄。囊壁外周大多有无色透明的折光环带，似晕圈状。卵囊内有4个香蕉形结构，即子孢子，还有一团暗黑色颗粒状的残体。子孢子～般周围深染，中央淡染，无孢子囊。在油镜下对5个隐孢子虫分离株均随机测量30个卵囊，其大小平均为7．58岬×6．20¨m[(6．07．8．09)岬×(4．04．7．08)岬]，卵囊形状指数为1．22。根据卵囊的大小和形态，初步鉴定为安氏隐孢子虫(C仰啪腩甜聊臼"如船D玎力。图2·2合肥奶牛源隐孢子虫卵囊(改良抗酸染色法，x1000)F培．2-200cystsofC哆『pfoEpor油蝴f．romcowofHefei(Modifiedacid-faststaining，×1000)2．1．3隐孢子虫的分子鉴定(1)隐孢子虫18SrRNA部分序列的扩增、测序和分析对5个牛源隐孢子虫分离株的18SrIⅢA部分序列进行PCR扩增和巢式PCR扩增均成功扩增出牛源隐孢子虫的18SrRNA基因(GenBank登录号分别为JQ031803、JQ031804、JQ031805、JQ031806、JQ031807)，18SrRNA基因的PCR扩增产物和巢式PcR扩增产物的长度分别为540bp和250bp，电泳图见图2．3和图2—4。26 M1234SS40bO图2．318SrRNA基因PCR扩增产物电泳图Fig．2-3ElectrophoresisofPCRpmductof18Sr】RNAg明eM：DNA标志物；l：髓l：2：HF2：3：船3：4：唧4：5：腰5M：DNAm越蛔；l：邯l；2：HF2；3：心3：4：唧4；5：断5250tt图2．418Sr鼢叮A基因巢式PCR扩增产物电泳图Fig．2．4ElecnIophoresisofnestedPCRpmductof18SrRNAgeneM：DNA标志物：l：唧；2：脏2；3：耶3；4：耶4：5：HF5M：DNAmarker；l：HFl；2：HF2；3：HF3：4：HF4；5：HF5经DNAStar分析软件进行序列一致性分析发现所分离的5株隐孢子虫与安氏隐孢子虫f1G口础瑚刀砂DQ989573的序列一致性为87．9％一99．2％，均高于5株隐孢子虫与其他序列的序列一致性，见图2．5。因此，初步鉴定本次分离的隐孢子虫为安氏隐孢子茧(C．nndersoni)opppppbbbbb00000O0505O007S2121 P日rcenlldent咐'23‘56709恤1''2’3'．15伯'7'8f●■187597．，9r397．，3058袅599．2e2074．6，8．tN．696．178．17a5，73930，8．5fHFla294l■■∞．6902∞．627．37B．187．973．O66．069967．28●．870．37'．'朗18●07072HF2a3O●B9■■Igg6。100．030．087．597．382．17477B．67599●．2珀079．877．89347943HF3a●08鱼304I■_蚰63●8872弱98，77‘37827559曼87丑679●7749307904HF●a50●e．900．●曩_30．OB7．597．382．17●778．675．99●．279．079877893479．●5HF5a667477067●69467●■■119R227‘'●417‘'54'自“9．1e¨．341．74564136CandersoniAY881992751163●45．1‘●丽i|—■B1．25●．651．652．351．358351．453．‘轴557651．37C．^ndersonI^Y9548878089‘040．80●50．6g2I■_89886387．7878987盯6B75髓197●8768CAndersoniDQ9895739'0．720310．’10610．146．32695．7■■_B’●93．793B引．293693．5明．692193B9CbaIIe”^F093●95伯'●7238'．21●B'●2‘8228I8640l—■92．6∞98&●B3g9●．4∞781OB3410Cre¨s^F’08882'111，0200’0．510910．5●6．727．76．63423曩■19e299．798．●97997．090798．311CmeIeagn枷s^F11257●12108’96'03108'0．347527．98．736：2．50．9；■■_e92明598．797．0904986'2CNousegenoⅣpe^F10e863'320105162．01650’2B．30．75．37．1616．1■lB9，09．0ag．3971明．313Cm洲sMousegeno坤pe^F09349e1411．3203’0．8i”3'08‘7．B27．9&g352‘O．8026．2，■■■■98．797．090298814C口aMJmAFl08884'5104’929910‘9．9●6．72776．73．62．60．g066．105■■_驰．59039日3'5C口anum^F”25691●”．520510．91’‘10g●7．728269I．12．●0．g’．063’11．2●gO396．8'6C．pIgAFl0886’'73712‘3236324882&21．5‘75．851i01．9514953曩一∞．617CserDen的^F093‘991811．420●10．9114’09●7．427B7034260906305081249l■_18CwraInAFll5378'23456789伯11'213'I'5'617'B图2．5DNASt甜分析的合肥地区奶牛隐孢子虫5个分离株18s“水A部分序列与其它隐孢子虫株相关序列核苷酸序列同源性Fig．2-5Percentsimilari哆锄ddiVe唱enceofl8SrRNAfortlle5cowC仰f0置印，砌材misolate厅omHefeia11domerc，即^唧Dr砌姗species龇dgenotypesinfeH谢肺mDNAStar采用DNAstar软件中的MegAlign程序对合肥奶牛隐孢子虫5个分离株18SrRNA基因序列系统发育关系进行分析，绘制的进化树见图2．6。从该图中可以看出，5株隐孢子虫与安氏隐孢子虫他册沈坶鲫砂DQ989573亲缘关系最近，在～个进化分支上。以上结果表明本次分离的5株隐孢子虫分离株均为安氏隐孢343——————1———————1———————1———————1———————_r———————_r———————]子喹lfC．nndersoniloHF3aC．AndersonjAY954887HF5aHF4aHF2aHFlaC．AndersonjDQ989573C．murIsMousegenoⅣpeAF093498C．serDenlIsAF093499C．Mousegeno母peAFl08863CDa～umAFl08864C．DarvUmAFl12569C．w旧iriAFll5378C．meIeaaridiSAFll2574C．pj口AFl08861C．『ellSAFl08862C．ba¨eViAF093495C．anderS0niAY881992302520151050NucIeoadeSubst．1ulions(x100)图2—6合肥奶牛隐孢子虫5个分离株18srRNA部分序列DNAstar聚类分析进化树Fig．2．6Phylogeneticrelationships锄ong5cow(功fD雌砌厂fd甜坍isolatef‘romHefeiinferredf．romDNAStaranalysisofl8SrRNAnucleotidesequence28西兰∞已堂5 (2)隐孢子虫HsP70部分序列的扩增、测序和分析对5个奶牛源隐孢子虫分离株的HSP70部分序列进行PCR扩增和巢式PCR扩增，均成功扩增出牛源隐孢子虫的HSP70基因(GenBank登录号分别为JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ031811、JQ031812)，HSP70基因的PCR扩增产物和巢式PCR扩增产物的长度分别为448bp和325bp，电泳图见图2—7和图2．8。M123452000bDl∞ObD750bD500bD250bD100bD图2．7HSP70基因PCR扩增产物电泳图Fig．2-7ElectrophoresisofPCRproductofHSP70geneM：DNA标志物；l：HFl：2：HF2；3：HF3；4：HF4；5：HF5M：DNAmarker；l：HFl；2：HF2：3：HF3；4：HF4：5：HF5325bp图2．8HSP70基因巢式PCR扩增产物电泳图Fig．2-8E1ectrophoresisofnestedPCRproductofHSP70geneM：DNA标志物；l：HFl；2：HF2；3：HF3；4：HF4；5：HF5M：DNAmarker；l：HFl；2：HF2；3：HF3；4：HF4：5：HF5牛源隐孢子虫分离株HSP70序列与GenBank相关序列同源性比较结果见图2．9。 经虫DNAStar聚类分析表明：HFl、HF2、HF3、HF4和HF5株隐孢子虫与安(C口玎如啪，z力AY954892和DQ989576序列同源性相似度分别为80．5％、80．8％、80．2％和97．2％。虽然与其他有的虫种AF401505、C聊P，曲矿矗加AF22l537、C．p口w材m氏隐孢子80．8％、(如C沈f坦)，AF093495、C．厅Dm加括AF221543、Cp口w堋?AF221530、C．w厂口护fAF221536)的相似度也能达到80％以上，但由于隐孢子虫的宿主特异性以及卵形指数等特征，可以排除，由此可认为所分离的5株隐孢子虫为安氏隐孢子虫●e口玎c跑，苫D”砂。PercentIden廿坤1234567B9'01112'3'4'5'6171■■lgg799．797．8833日0．580．5B2．IB1477．●81481779．302．0B20783e201HFlb2o3|—■1∞．0981836808日0882．782．078．082．082479．682．78277868272HF2b3030．0l■■98183680880．882．782078．082．082．479682．78277868273HF3b4060．3o3曩■B3080280．281．180．576．180580．8789引．1引17808114HF4b51515．1151146l■●97297．282．776．271275976．595478．37689267685HF5b6186182182172．5曩■I99．483．578．573077．278097878978194．77876CandersoniAY9548927186182182172．50I■_83．978．673．677．97849837927B49567867Canderson}DQ989576818718．3183’8617．1'5615．B■■一g，R76．183．g83183983983．g8418368CbaileviAF221539918．718318318．623121．021．11B7■■_83．698．39547849219B57909759CbaⅥs^J310881'02●．223723．72●129127．4277269”9啊■●82883273．6e34830735832柏Cfe“sAF221538111861e218．218523121121．216●’B17gI■_gSl7e492．3977776978'1ChominisAF4015051217917517517e2272122’21763917e30啊■l70690．49557e595212CmeIeag州is^F221537'320319．81g81g44．5171．715．62’4279214211蛋■一79678595678813CmurisAF221543'417417017017320920220．416．18．11837．991200l■I92079592114C口aMml^F221530'517817417‘1722．221221．●16．●1．51821．73921‘811■■_7B597815CpaMmmousegeno婶pe^F221530'622021．62162117．6‘74．●15820827721521543203217l_79216CsementlsAF2215●11717．817．●17‘1722220．420．716．11．g17．82034208752'n口：■■_17CwramAF221536123456789'01112'3141516'7图2—9DNAstar分析的合肥奶牛隐孢子虫5个分离株HSP70部分序列与其它隐孢子虫株相关序列核苷酸序列同源性Fig．2—9Perccntsimil耐ty锄ddiVergenceofHSP70fortIle5cowc，弦fn印Dr砌“肌isolatefbmHefeiandotllerC仰fD置缈触甜mspecies锄dgenotypesin俺仃ed硒mDNAStar采用DNAstar软件中的MegAlign程序对合肥奶牛隐孢子虫5个分离株HSP70基因序列系统发育关系进行分析，绘制的进化树见图2—10，由图可知，此5株隐孢子虫与安氏隐孢子虫心口，?沈脚玎f)AY954892和DQ989576、鼠隐孢子虫似m甜r例AF221543、蛇隐孢子虫flesP印P掰圳AF221541、在一个进化分支上。但由于贝氏隐贝氏隐孢子虫他6Df姆{)AF221539亲缘关系较近，孢子虫宿主特异性【60】，故可排除贝氏隐孢子虫，可以看出本次分离的5个隐孢子虫分离株均为安氏隐孢子虫孵口”沈瑚。玎砂。 11·0———]————————T_———————_T————————广———————T———————]086420NucIeoadeSubslilulions(x100)C．anderS0ni^Y954892C．anderSOniDQ989576C．mUnSAF221543C．Semen廿S^F221541HF5bC．bajI洲AF221539HFlbHF2bHF3bHF4bC由0vISAJ310881C．paⅣummousegeno忡eAF221530C．homjniSAF401505C．WrairiAF221536C．meIeaandisAF221537CDarvUmAF221530Cfe¨sAF221538图2-lO合肥地区奶牛隐孢子虫HSP70部分序列DNAStar聚类分析进化树F培2·lOPhylogeneticrelationships锄ong5cow铆卿，协坍isolate仔omHefeiinfe盯edfmmDNAstar锄alysisofHSP70nucIeotidesequence2．2隐孢子虫囊壁蛋白基因的克隆2．2．1囊壁蛋白基因的PcR扩增结果对奶牛源隐孢子虫分离株囊壁蛋白(COwP)基因部分序列进行PcR扩增，产物的长度大约为499bp，与预期一致，其电泳图见图2．1l。勺499bp图2-llCOWP基因PCR扩增产物电泳图Fig．2·llElectrophoresisofPCRproductofCOWPgeneM：DNA标志物：l：COWP基凶M：DNAnlarker；l：COWPgene3l 2．2．2囊壁蛋白基因的测序结果分析隐孢子虫囊壁蛋白基因部分序列的测序结果为499bp，碱基序列如下，见图2—12。TGGAAGAGArTGTGI．AGCGrn_rCTCCACCTGAr从ATCTTGTCCTCCAGGTmACATTTTCAGGGAAGCAGTGTGTACAGTCTG』气1'ACTGCACCTCCCAACCCTGAATGTCCTCCTGGGACTGl：ATTGGAGAATGGAACATGCAAACTC朋厂rCAGCAAGl．AG觚ACl'ATATGCCCACCTGGGrrTGTTGAGGAGGGAAA1’AGATGTGTCCAG，rⅪTTGCCAGCAAACAAATAT(汀CCACCAGGT兀HATCTATCTGGGCAGCAATG耵虹GGCACCTGAATCAGCAGAArI．AGAATCAACTr(汀CCTCCAA加rACAATATTGGAGAArGGAAAGTGTAAGGTCATTAAAAATGlAGAlHllGGTGTGTCCCCCAGGn'加脯CAGACTCTGGAGArGAATGTGl’ACTTTArGTGGCTCCAGCL～AGGAGTGCCCCCCAAArr兀ACACTGCAAGGGrrGCAATGTGTTCAAACGAACACCGCATCAACACAACCAGTA≤之剥饿测)5：耐籼慨藤汛批舭溅^嗽㈧k如i赫成批燃6撒撇燃溅黼㈣§融删舢‰翩洲删瓣懒飙‰。㈣嫡涮‰灞艨翩础心瓣懒0』氯麟漱对蛹‰南讨缕＆潞瓣以Jk5锛臀漶黼志础‰翩呶》锑镰舟涮慨惝燃溉‰挑础漱㈣删蛔㈣麟蝴燃漱㈧8撇‰翩删㈣漱础瓣鲰汹㈧黼洲础㈣渤獬㈣图2．12COwP基因测序图Fig．2一12ElecnDphoresisofPCRproductofCOWPgene将所得序列在NCBI网站上进行核苷酸序列比对(BLAST)得到的结果显示，此次扩增的CoWP基因序列与所报道的安氏隐孢子虫旺册沈坶。胛f)囊壁蛋白基因部分序列(GeneBank登录号为DQ989570)进行比较，序列覆盖率为100％，相似性为100％，表明成功克隆了安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因部分序列，获得了合肥地区奶牛源安氏隐孢子虫囊壁蛋白基因部分序列，见图2—13。32 >止二』垡垫_L三坚￥兰垒呈王掣cryp七osporidiumandersoniisolatec肼oslloocys七vallpro七eingene，par七1alcd暑LengChl551score=922bi七s(499)，Expect=O．0j璺enc!七三号5亏一÷99／辱99c100％)，GapsIo／哇99Io％jS七rand=Plus／PlusQueryiSbjcc9Query61Sbjc七69Query121Sbjc七129Query18lSbjc七189QueryZqlSbjc七2q9Query30iSbjc七309Query361sbjcc369Queryq2lSbjc七q29Queryq8lSbjctqB9上!!!!!!i!上上!L!!lIIlII|llIIIlIII|III|I|IIII|II|III|IIIlTGG从GAG^TTGTGT^GcG册cTccAccTG^T从^TcTTGTcc记亡jL赫请tt址i请68TTCAGGGAAGC^GTGTGT^CAGTCTG且T^CTGC^CCTCCCAACCCTG^^TGTCCTCCTGG】2口从!!!!!!!l!!!上【上【|IIIJIIIlI||IfIIII||IlIII||IlII|||lIlTTcAGGGAAGcAGTGTGT^c蝎TcTGATjJCTGc^ccTccc“亡e亡记“士6记亡谜亡士的i28GACTGT^TTGG^G^且TIW从C^TGCn置CTc^TTC量0C从GT且G^T^CT土T鱼TGCCC量CC】8凸!!!上!上!U!!!!!HIlllI|||Ill|If|II|III|lII||I|Ill|II|I|I|I|IIGAcTGTATTGGAGA且TGG且AcAT6c^▲AcTcATTcAGc且A6T^GAT且ctjLTi士6亡亡亡量亡亡188TGG6TTTGTTGAGGAGGG且^^T且G^TGTGTcC^GT^mGcC^GcAA^C从^ATATGTCC24口上!I!上从iU!}!!!i!!!|I|IIII||III|IIII|Il||I|IIJ|IlIII||IlIITGGGTTTGTTGAGGAGGGn^T^G^TGTGTcc^GT且TTT6ccjL托jLi妊“ii千i士6千亡亡2J鲁8ACCAGGTTTTAATCT且TCTGGGC且GCAATGT且TGGCACCTGAATCAGCAGA^TTAG^^TC30011l!!旦jlII|l||III|Il|lIII||II|III||II|IIl|IlIIlI||I|III|AccAGGTTTTAATcTATcTGGGcAGcAATGTATGGcAccTGAATcAGcAGAATtAGijLt亡308A直CTTGTCCTCCAA且T且C^AT且TTGG且G从TGGAA^GTGTAAGGTCATT从^A^TGT且G^3601l!i．I|IlI|IIlII|I|IlIIl||I|I|IIfII|IlIIlI|l|IIII|l|II|III|AAcTTGTccTccA直ATAcA^TATTGGAG^ATGGA^AGTGTAAGGTc^TTA^AiiT6亍i6i368TATGGTGTGTCCCCCAGGTT且TACAGACTCTGGAGATGAAT6TGTACTTTATGTGGCTCCq20上!上i!上!上!上!||lIl|I|I||IlIl|fI||II|I|IIIII|||fIIII|I|III||||ITATG6TGTGTccccc且GGTTATAcA6且cTcTGGAGATGAATGTGTAcTttjL千6千6e亡千亡亡q28AGCT^AGG^GTGCCCCCC且A^TTTT且CACTGCAAGGGTTGCA且TGTGTTCAAACG且^CACq8011iL!!!!!!!|IlIIIIl||I|III|Illl|lIIIlII|IIII|III|I||I|IAGCT^AGGAGTGCCCCCCA且ATTTT^CACTGCAAGGGTTGCAATGTGTTCAAACGA^C且Cq88CGCATCAACACA^CCAGTA哇99IIl|IIIII|IIIII|lIICGC置TC直矗CACA^rr^G下量与n-7图2-13奶牛源隐孢子虫cOwP基因序列BlaStIl比对结果Fig．2·13TheBlaS恤resultofcowiS0latedC叮ptosporidi啪COWPgene33 3讨论3．1合肥某奶牛场成年母牛隐孢子虫感染情况本次对合肥地区某奶牛场285头成年母牛粪样检测发现，饱和蔗糖溶液漂浮法隐孢子虫检出率为1．8％，改良抗酸染色法隐孢子虫检出率为2．1％，其检出率与梁楠等14纠的报道基本一致，但国内广东、青海、南京和无锡奶牛隐孢子虫的检出率分别为8．46％、11．00％、32．73％和21．43％【551。该场成年母牛隐孢子虫的检出率低于上述省市，其原因可能是由于该场地处合肥市远郊，离主要公路和村庄较远，奶牛饲养管理和卫生条件较好的缘故。饱和蔗糖溶液漂浮法检出的5份隐孢子虫阳性粪样，用改良抗酸染色法检查均为阳性，而饱和蔗糖溶液漂浮法检测阴性的粪样，用改良抗酸染色法却检出l份阳性，两种方法存在的差异有可能是因为改良抗酸染色法所利用的隐孢子虫抗酸特性在其他虫卵或物体也存在，石碳酸复红染色时间稍长，导致酵母或其他的耐酸性质弱的物体着色而出现假阳性所致【61|。用饱和蔗糖溶液漂浮法所获隐孢子虫卵囊为椭圆形或卵圆形，其大小平均为7．37岬×6．13¨m[(6．07．8．09)岬×(4．04．7．08)岬]，卵形指数为1．20；改良抗酸染色法所获卵囊为椭圆形或卵圆形，大小平均为7．58岬×6．20um[(6．07．8．09)岬×(4．04-7．08)肛m]，卵形指数为1．22，两种方法检出的隐孢子虫卵囊与Lindsay，Ds【62】、刘海鹏等【52】、梁楠等【43】报道的安氏隐孢子虫形态特征基本一致，故初步鉴定本次分离的隐孢子虫为安氏隐孢子虫fle以玎沈瑚D玎砂。美国LindsayDS【62】2000年报道从牛体内分离出的隐孢子虫，其卵囊大小平均为7．4×5．5um(6．0．8．1×5．0．6．5um)，卵形指数平均为1．35(1．07-1．50)，根据卵囊壁、卵囊内部结构等的描述以及分子生物学方法最终将此隐孢子虫确定为隐孢子虫的一个新种：安氏隐孢子虫，这是人类首次为安氏隐孢子虫命名。目前公认的寄生于牛的隐孢子虫有4个有效虫种，分别为微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫、牛隐孢子虫和赖氏隐孢子虫【63】，在我国安氏隐孢子虫是奶牛最常见的种类【43)52J。3．2奶牛源隐孢子虫的分子鉴定由于隐孢子虫虫种间在形态学方面非常相似，且隐孢子虫寄生宿主众多，无严格的宿主特异性，国内尚无系统的隐孢子虫虫种分类和基因分型的相关报道。因此，迄今我国隐孢子虫种分类仍不明确。传统的形态学方法是利用形态学差异和宿主特异性作为依据，但在无上述明显差异时，难以准确鉴定隐孢子虫虫种。因此，分子生物学技术的蓬勃发展及其广泛的应用为隐孢子虫虫种鉴定和基因分型提供了新的方法[1，521。目前，用于隐孢子虫分类的基因主要有18SrRNA基因和HSP70基因，此外，二氢叶酸还原酶、血小板反应蛋白．相关黏附蛋白(TRAP．C1和TRAP—C2)、CoWP基因、 胸苷酸合成酶(dh肌s)基因和一些功能未鉴定的基因片段等也可用于隐孢子虫的种类鉴定畔j。本研究选用隐孢子虫18SrRNA基因和HSP70基因作为隐孢子虫种系发育分析研究，18SrRNA基因是一个稳定的多拷贝基因，其灵敏性高于使用单拷贝基因序列，而HSP70基因属于管家基因家族，高度保守，具有种内种间鉴别位点，常被用来作为隐孢子虫分类时的靶基因。根据隐孢子虫18SrRNA同源性分析表明，本次检获的5个隐孢子虫分离株与安氏隐孢子虫DQ989573的序列一致性为87．9％．99．2％，均高于其他相关序列；而这5株隐孢子虫分离株的HSP70基因序列与安氏隐孢子虫AY954892和DQ989576的序列一致性为80．3％．97．2％。因此，可将此次分离的奶牛源隐孢子虫鉴定为安氏隐孢子虫弼册沈瑚玎砂。安氏隐孢子虫为一种人兽共患寄生虫p‰65J。该奶牛场有安氏隐孢子虫阳性奶牛，提示合肥地区存在隐孢子虫病原，应重视人兽共患隐孢子虫病的防控，儿童和免疫功能低下者更要加强防范。鉴定结果表明，本次分离的5株隐孢子虫均为安氏隐孢子虫以册沈瑚D刀砂，但尚不清楚是否为新的种类或基因型，对此仍需进一步研究来证实。本研究获得了合肥奶牛源隐孢子虫5个分离株，扩增出其18SrRNA基因(GenBank登录号分别为JQ031803、JQ031804、JQ031805、JQ031806、JQ031807)和HSP70基因(GenBank登录号分别为JQ031808、JQ031809、JQ031810、JQ031811、JQ031812)，填补了合肥牛源隐孢子虫分子鉴定空白，为今后合肥地区奶牛隐孢子虫病的防控提供了理论依据。3．3隐孢子虫囊壁蛋白的研究隐孢子虫的感染与传播是以卵囊形式在宿主之问进行的，虫体在胃肠道内脱囊释放出子孢子并侵入胃肠道上皮细胞，寄生于小肠上皮细胞刷状缘的纳虫空泡内。这个过程隐孢子虫与宿主间的相互作用机制尚未被完全阐明，而该作用机制又可能对隐孢子虫防治策略的制定至关重要，且由于目前尚无有效的隐孢子虫病治疗药物，因此对该病治疗和预防的重点在于了解隐孢子虫卵囊或子孢子表面的候选靶抗原，为制备特异性抗体和疫苗提供依据。目前隐孢子虫核酸疫苗方面的研究大多集中于微小隐孢子虫，已公开发表的与微小隐孢子虫核酸疫苗相关的蛋白有子孢子表面抗原gpl5、gp40、gp23、氨甲酰基磷酸合成酶一500(CPS一500)和环子孢子样糖蛋白外抗原(CSL)，微线蛋白gp900、TRAP．C1、SCRP，卵囊壁蛋白COWP和热休克蛋白HSP70等。安氏隐孢子虫心口，7沈坶D州作为独立的一个新种，是人畜共患隐孢子虫病的主要病原之一，对奶牛等反刍动物尤其是幼畜的危害非常严重【56|。有研究表明，有的抗原成分在隐孢子虫种间并无交叉性，因此，以安氏隐孢子虫化册如坶D”力抗原分子为靶基因进行安氏隐孢子虫核酸疫苗的研究很有必要。本课题从提取安氏隐孢子虫总RNA开始，进行总RNA反转录后以cDNA为模板扩增出CoWP基因部分序列，通过BLAST比对发现所获安氏隐孢子虫CoWP基因序列与GeneBank发布的DQ989570序列覆盖率 为100％，相似性为100％，表明此次成功扩增出安氏隐孢子虫cowP基因。囊壁蛋白是卵囊壁表面重要蛋白之一，COWP聚集在成熟大配子的成壁小体并最终定位于卵囊壁的内层，被认为是一种很有前途的疫苗候选抗原。因此，CO肿基因的成功克隆为安氏隐孢子虫似口”如瑚玎砂疫苗的研制提供了候选抗原材料。 结论l。采用饱和蔗糖溶液漂浮法和改良抗酸染色法对合肥某奶牛场285头奶牛粪样进行了隐孢子虫检测，其检出率分别为1．8％和2．1％；分离出5株隐孢子虫，经形态学初步鉴定均为安氏隐孢子虫似仰f唧D，f岱甜m册d哪伽砂。2．根据隐孢子虫18SrRNA和HSP70基因序列合成特异性引物，以所获5株隐孢子虫基因组DNA为模板进行PCR和巢式PCR扩增，对巢式PCR产物进行测序和分析，确定均为安氏隐孢子虫化绷d跏D"砂，GenBank登录号为JQ031803．JQ031812。所获合肥奶牛源隐孢子虫分离株，为今后隐孢子虫病的诊断、分子生物学检测及虫种鉴定提供了依据。3．根据隐孢子虫COWP基因序列设计并合成特异性引物，以隐孢子虫cDNA为模板进行PCR扩增，产物经克隆、测序与分析，表明成功克隆了安氏隐孢子虫COWP基因片段，其结果为今后隐孢子虫疫苗的研制奠定了基础。 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致谢本论文是在导师李培英教授和张丹俊副研究员的悉心指导下完成的，从日复一日的耐心指导到一字又～字的细致修改。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。学习期间，导师还在思想上给予教诲、生活上给予无微不至的关怀和帮助。本论文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢!本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感谢王菊花老师、薛秀恒老师的指导和帮助；感谢徐前明、李瑾年、魏建忠、李郁、王桂军、孙裴等老师的指导和帮助；在三年的学习期间，感谢本实验室王小龙师兄、仝彩铃师姐，同届的刘维、孙伟，以及袁恒青、张龙乐、刘思嘉、刘富等师弟和查国飞、徐颖师妹的关心和帮助，在此表示深深的感谢。没有他们的帮助和支持是没有办法完成我的学位论文的，同窗之间的友谊永远长存。同时，向多年来养育我的父母献上最真诚的感谢和最衷心的祝福。最后，向三年来一直关心和支持我的老师、同学、亲朋再一次致以最诚挚的谢意142 作者简介姓名：孙涛性别：男籍贯：安徽省凤台县出生年月：1985．10学位：农学硕士专业：预防兽医学政治面貌：中共预备党员教育经历：2005年9月——2009年6月安徽科技学院动物科学学院农学学士2009年9月——2012年6月安徽农业大学动物科技学院农学硕士在读期间参与科研项目：1．国家自然科学基金项目，项目编号3100lOl92．安徽省自然科学基金项目，项目编号0704110l8在读期间发表的学术论文：[1】孙涛，刘维，王菊花，等．合肥地区奶牛源隐孢子虫的分离与鉴定[J】．中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2011，29(6)：447—452．