hepis基因功能的初步研究

《hepis基因功能的初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中图分类号：Q291论文编号：HBLG2015-003UDC：密级：公开硕士学位论文HEPIS基因功能的初步研究作者姓名：U罗萌萌学科名称：U病原生物学U研究方向：U功能基因组学学习单位：U华北理工大学U学习时间:U3年U提交日期:U2015年5月10日申请学位类别：U理学硕士导师姓名：U张秀军教授U单位：U华北理工大学生命科学院论文评阅人：高俊玲教授单位：华北理工大学基础医学院张志勇教授单位：唐山市工人医院论文答辩日期：U2015年5月30日U答辩委员会主席：汤华教授关键词：HEPIS；双荧光素酶报告；NF-κB通路；细胞

2、增殖唐山华北理工大学2015年6月PreliminaryFunctionalAnalysisofHEPISGeneDissertationSubmittedtoNorthChinaUniversityofScienceandTechnologyinpartialfulfillmentoftherequirementforthedegreeofMasterofSciencebyLuoMengmeng(PathogenicOrganisms)Supervisor:Ph.DZhangXiujunJune,2015独创性说明本人郑重

3、声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得华北理工大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。论文作者签名：日期：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解华北理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论

4、文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检索和交流。作者及导师同意论文公开及网上交流的时间：□自授予学位之日起；□自年月日起。作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要摘要目的通过对人类睾丸组织高表达的四百多个未知功能基因进行大规模基于双荧光素酶活性检测的信号通路筛选，发现了一批激活或抑制信号通路的阳性基因，能够显著上调或下调内参萤火虫荧光素酶活性。从中选择显著抑制NF-κB信号通路的基因HEPIS（HumanembryolungcellularproteininteractingwithSA

5、RS-CoVnsp-10，HEPIS）进行功能研究。生物信息学分析HEPIS基因，初步了解其基本理化性质、对应蛋白质的结构并预测其功能；通过半定量-PCR研究HEPIS在不同组织的表达谱；预测和验证HEPIS蛋白的亚细胞定位；分别构建高效HEPIS真核表达质粒和siRNA沉默子，体外瞬时转染肾细胞系293T和肾癌细胞系A498，通过细胞形态及功能的变化探讨HEPIS基因抑制细胞增殖的机制，为开发有重要生理活性及临床应用前景的新功能基因奠定基础。方法1目的基因的筛选：分析海肾/萤火虫荧光素酶双报告基因系统对NF-κB、CRE、

6、Wnt和HRE四条通路大规模筛选的结果，选择HEPIS为本次研究的目的基因。2生物信息学分析：通过各种分析软件和生物信息学预测网站预测分析HEPIS基因的核酸及HEPIS蛋白质的序列组成、理化性质、定位、信号肽、跨膜结构域、物种同源性及二级结构等。3表达谱分析：利用半定量RT-PCR技术检测HEPIS基因的在多个细胞系中的表达谱，选取目的基因对细胞增殖影响研究的适合细胞系。4真核表达质粒的克隆构建：利用分子克隆技术将目的基因HEPIS的CDS区插入到pCMVSPORT6、pEGFPC3、pEGFPN1的真核表达载体上。5亚细

7、胞定位：将HEPIS-pEGFPN1和HEPIS-pEGFPC3分别转染入293T细胞，荧光显微镜下观察融合的绿色荧光蛋白在细胞内位置，推断蛋白定位。6使用引物设计软件针对HEPIS的CDS区设计、合成并扩增针对目的基因的siRNA片段，使之形成HairpinsiRNA结构，有效沉默目的基因，并且通过实验验证沉默与过表达的效率。7功能实验：通过对细胞形态的观察、克隆形成、划痕实验、CCK8试剂盒检测等来验证过表达和沉默HEPIS对肾细胞系293T以及肾癌细胞系A498增殖的影响。8HEPIS抑制细胞增殖的机理：首先通过转染使

8、HEK293T细胞过表达或沉默HEPIS，然后利用血清饥饿培养使细胞周期同步化，最后通过流式细胞术检测细胞周期，明确HEPIS影响细胞周期的途径。结果1筛选结果显示HEPIS显著下调NF-κB的活性。2生物信息学分析显示：HEPIS全长666bp，CDS区444bp，可编码出一个147个氨