单核细胞增多性李斯特菌溶血素llo的功能关键位点鉴定及表面展示系统的构建

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1、ｗｍｍｋｍ’；－．；硕±学位论文心单核细胞增多性李斯特菌溶血素ＬＬＯ的功能关键位点鉴定及表面展示系统的构建＇作者姓名：武晓林指导教师：宋厚辉研究员学科专业名称：动物学研巧方向：动物疾病防控所在学院：农业与食品科学学院动物科技学院论文提交日期：？２０１５年６月１曰浙江农林大学２０１５年６月１日？■ｒ独创性声明本人声明，所电交的学位论文，是在指导教师指导下，通过我的努为取得的成果，并Ｕ是扫己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己经作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的

2、研巧成果，也不包含在浙江农林大学或其他教育机构获得学位或证书而使用过的一材料，。。与我同对本研究做化贡献的同志都在论文中作了明确的说明井表示了谢意如被查有严垂侵犯他人知识产权的巧为，由本人承担应有的责任。：Ｉｔ咚杜日期学位论文作者亲笔签名；如论文使用授权的说明本人完全了解浙江农林义学有关保留、使用学位论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，；学，可、允许论文被杳阅和侶阅校可Ｗ公布论文的全部或部分内容ｔａ采用影印缩巧或其他复制手段保存论文。保密，巧年后解密可适用本授权书。□不保密。心，本学位论文属于不保密。’（请巧框内小）方打？Ｕ论文签

3、名：日：旅学位作者亲笔期＾＿＿逝虔名巧导巧师東笔签名：一Ｕ期：各ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMasterFunctionalKeySitesIdentificationofListeriolysinOandSurfaceDisplaySystemConstructionusingListeriamonocytogenesasamodelstrainCandidate:WuXiao-linAdviser:SongHou-huiProfessorSpeciality:ZoologyDateofSubmission:Ju

4、ne,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,Zhejiangprovince,P.R.ChinaJune,2015摘要摘要单核细胞增多性李斯特菌（Listeriamonocytogenes,LM），简称单增李斯特菌，是一种革兰氏阳性、食源性胞内病原菌。LM主要通过分选酶（Sortase）系统将含有LPXTG基序的蛋白锚定至胞壁并发挥相应功能。溶血素ListeriolysinO（LLO）是属于依赖于胆固醇的膜穿孔蛋白家族（CDCs），在游离状态下可以形成直径35nm的孔状结构，插入到宿主细胞膜内，在李斯特菌逃离到细胞质中扮演着重要的角色。本研究分别以单增李斯特菌参

5、考菌株EGD-e和弱毒株M7溶血素蛋白（ListeriolysinO，LLO）为研究对象，通过同源重组及氨基酸突变技术将编码LLO蛋白的基因hly在基因组水平上进行如下修饰：（1）构建LLO缺失突变株（ΔLLO）；（2）将野生株LLO蛋白第472-483位氨基酸缺失，使其形成携带LPXTG基序的重组LLO菌株（LLOLPXTG）。Westernblot试验结果显示EGD-e和M7菌株缺失LLO后均未检测到LLO蛋白的表达，而LLOLPXTG缺失株检测到重组LLO蛋白的表达，证实ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株均构建成功；鼠源巨噬细胞RAW264.7胞内增殖试验表明，EGD-e的ΔL

6、LO缺失株和LLOLPXTG缺失株的胞内增殖力显著减弱；溶血试验表明，M7的ΔLLO缺失株和LLOLPXTG缺失株的溶血活性完全丧失。体外原核表达纯化LLO及其第472-483位氨基酸突变体蛋白，并研究其体外溶血活性。结果显示只有LLO第478和479位氨基酸影响LLO的溶血活性。体内外试验表明单增李斯特菌LLO蛋白与细菌感染宿主细胞后的增殖能力密切相关。本研究首次发现并证实LLO第472-483位氨基酸为其关键位点，决定了LLO的活性及功能。LLO缺失株的构建可以为细菌体内表面展示技术在宿主细胞内进行抗原展示和递呈的研究奠定重要基础。综上所述，本研究首次发现并证实单增李斯特菌LLO第4

7、72-483位氨基酸为其关键位点或功能域，决定了LLO的活性及功能；单增李斯特菌LLOLPXTG表面展示重组菌株为将来胞内菌的抗原展示技术开发提供了一种工具，可用于病毒病的预防和治疗。关键词：单核细胞增多性李斯特菌，溶血素LLO，LPXTG，同源重组，表面展示系统IABSTRACTABSTRACTListeriamonocytogenes(LM)isagram-positiveandfood-borneintracellularpa