抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

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1、抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定：董慧,焦新安,殷月兰,潘志明,黄金林【摘要】　　目的:研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb)。方法:通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX6p1hly),以SDSPAGE分离菌体蛋白,切割目的蛋白LLOGST条带,研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。利用亲和层析法纯化目的蛋白,作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定腹水效价,DotELISA、)快速检测技术奠定了基础。【关键词】李斯特菌溶血素产单核细胞

2、李斯特菌单克隆抗体　　[Abstract]AIM:Topreparethemonoclonalantibodies(mAbs)againstlisteriolysinO(LLO),ajorvirulencefactorofListeriamonocytogenes.METHODS:TheBALB/cmicemunizedAbsagainstLLOphocytehybridomatechnique.ThespecificityofmAbsacelllinesnamed3B6,4D1and5D10secretingmAbsa

3、gainstLLOmunoglobulinsubclassesofthemAbsedthethreemAbsreactedonfusionproteinLLOGSTbutdidn’treactonproteinGST.DotELISAprovedthethreemAbsonlyreactonthebacteriaexpressingLLO.CONCLUSION:ThesuccessfulpreparationofthreemAbsspecifictoproteinLLOlaysafoundationforfurthe

4、rstudyofthebiologicalcharacteristicsofLLOandthepathogenesisofListeriamonocytogenes.　　[Keyonocytogenes;monoclonalantibody　　产单核细胞李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是一种胞内生长、兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,是李斯特菌属中致病性最强的一种。LM是一种重要的食源性病原菌,能引起人兽共患李斯特菌病[1]。在动物中,对多种畜禽均有较高的致死率;在人类,主要表现为脑膜炎、流产以及免疫

5、缺陷患者和新生儿的中枢神经系统的感染[2,3]。近年来,欧美许多国家均有过李斯特菌病暴发的报道,因此对LM的研究具有重要的公共卫生意义。LM的致病性由多种毒力因子决定,包括李斯特菌溶血素(listeriolysinO,简称LLO)、ActA蛋白、侵染性蛋白p60、内化素和磷脂酶C等[4],其中LLO是由LM特有的毒力标志基因hly编码的分泌蛋白,是LM的主要毒力因子。LLO是一种能结合胆固醇,可被巯基活化的细胞溶解素,相对分子质量(Mr)为60000[5]。LLO能够溶解宿主细胞吞噬体膜,使LM能够逃离噬菌体中的杀菌物质

6、,从而在胞质中增殖。另外LLO还能在感染细胞内诱导信号转导,这一特性已被应用于疫苗研究中[6]。关于李斯特菌属特异性单克隆抗体(mAb)的研制已有报道[7],但是特异性针对LMLLO的mAb国内尚未见报道。本研究中采用割胶免疫的方式研制针对LM特异性毒力因子LLO的mAb,为进一步研究LLO的生物学活性、致病性和免疫机制,建立快速检测LM的方法创造条件。　　1材料和方法　　1.1材料重组大肠杆菌BL21(pGEX6p1hly)、BL21(pGEX6p1actA)、BL21(DE3)(pETactA)、BL2

7、1(DE3)(pET)、BL21(pGEX6p1)均为本室构建、保存。其中重组菌BL21(pGEX6p1hly)携带hly基因,表达融合蛋白LLOGST;重组菌BL21(DE3)(pETactA)、BL21(pGEX6p1actA)携带actA基因。产单核细胞李斯特菌分离株LM03032002、LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、LM03041602、LMNJ1191、鸡白痢沙门氏菌由本室保存。高糖型DMEM粉、细胞融合用PEG（M抗体、鼠源mAb亚

8、类试剂盒、氨基喋呤(A)、次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶核苷(T)均为Sigma公司产品;RedipackGSTpurificationmodule为AmershamBioscience公司产品;其余试剂均为国产分析纯;小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0Ag14为本室保存;6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心