单克隆抗体与疾病诊断综述报告

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1、单克隆抗体与疾病诊断综述报告姓名：陈碧虹学号：01专业：生物班级：高二（7）指导教师：孙孺江时间：2008.1.1单克隆抗体含义我们人体中存在有一种十分有用的“健康卫士”，它称为B淋巴细胞。当外来细菌、病毒、或是异性物质侵入我们人体时，它们便立即产生一种对抗这些细菌、病毒或异性物质的“抗体”。抗体可把它们溶解或杀灭。正是由于抗体有这种功能，科学家们便想出了一种“细胞杂交”的方法，使这种抗体可以源源不断地产生。什么是“细胞杂交”、它又为什么可不断产生抗体呢？顾名思义，“细胞杂交”就是用两种不同的细胞将它们融合成一种细胞。为了制造特异性的抗体，科学家们将B淋巴细胞与一种瘤细

2、胞融合在一起，于是所产生的“杂交细胞”一方面具有瘤细胞不断生长繁殖的性质（科学家们称之为“永生不死性”），一方面又有B细胞产生专一抗体的性质。科学家们再将这种杂交细胞所产生的抗体提纯出来，这便是单克隆抗体了。单抗药物种类单克隆抗体药物的技术开发经历了鼠源单克隆抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体。鼠源性单克隆抗体由于有副反应，代谢快，除了部分放射性元素一般与此类单抗结合以达到治疗目的外，其余逐渐退出市场。人源化及全人源单克隆抗体由于副反应小，在体内停留时间长，有利于治疗，近年来开发的单克隆抗体主要是人源化的单克隆抗体。这三种治疗性的单克隆抗体都已经在美国上市。单

3、克隆抗体制备基本方法骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备选择瘤细胞株的最重要的一点是与待融合的B细胞同源。如待融合的是脾细胞，各种骨髓瘤细胞株均可应用，但应用最多的是Sp2/0细胞株。该细胞株生长及融合效率均佳，此外，该细胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链。细胞的最高生长刻度为9×105/ml，倍增时间通常为10～15h。融合细胞应选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞（活性应大于95％）。骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养，在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。在体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的

4、细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其他饲养细胞（feedercell）。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞，制备方法为用冷冻果糖液注入小鼠腹腔，轻揉腹部数次，吸出后的液体中即含小鼠腹腔细胞，其中在巨噬细胞和其他细胞。亦有用小鼠的脾细胞、大鼠或豚鼠的腹腔细胞作为饲养细胞的。在制备饲养细胞时，切忌针头刺破动物的消化器官，否则所获细胞会有严重污染。饲养细胞调至1×105/ml，提前一天或当天置板孔中培养。细胞融合细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是将两种细胞混合后加入PEG使细胞彼此融合。其后吧培养液稀释PEG，消除PEG的作用。将融合后的细胞适当稀

5、释，分置培养板孔中培养。融合过程中有几个问题应特别注意。①细胞比例：骨髓瘤细胞与脾细胞的比值可从1:2到1:10不等，常用1:4的比例。应保证两种细胞在融合前都具有较高活性。②反应时间：在两种细胞的混合细胞悬液中，第1min滴加4.5ml培养液；间隔2min滴加5ml培养液，尔后加培养液50ml。③培养液的成分：对融合细胞，良好的培养液尤其重要，其中的小牛血清、各种离子和营养成分均需严格配制。如融合效率降低，应随时核查培养基情况。有限稀释法筛选阳性株一般选用的骨髓瘤细胞为HAT敏感细胞株，所以只有融合的细胞才能待续存活一周以上。融合细胞呈克隆生长，经有限稀释后（一般稀释

6、至0.8个细胞/孔），按Poisson法计算，应有36％的孔为1个细胞/孔。细胞培养至覆盖0％～20％孔底时，吸取培养上清用ELISA检测抗体含量。首先依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，尔后进行抗原特异的ELISA测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。单克隆抗体的制备和冻存筛选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最

7、普遍采用的是小鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。接种细胞的数量应适当，一般为5×105/鼠，可根据腹水生长情况适当增减。选出的阳性细胞株应及早冻存。冻存的温度越低越好，冻存于液氮的细胞株活性仅有轻微的降低，而冻存在－70℃冰箱则活性改变较快。细胞不同于菌种，冻