几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究

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1、几种因素对噬菌体侵染大肠杆菌的影响研究吕玉红庞礴苏雅静刘谊岚王丽丽河北科技大学生物科学与工程学院河北石家庄050018摘要：通过利用λ噬菌体对大肠杆菌烈性侵染特性，研究了宿主生理状态、pH、宿主数量、金属离子及表面活性剂等外界因素对侵染过程的影响，结果表明：宿主生理状态最为重要，指数分裂期的宿主细胞最易受到侵染；pH6～8的中性条件下有利于噬菌体吸附增殖；100mg/L钙、镁离子能够促进吸附侵染过程；100mg/L铁离子和0.2%吐温80能够抑制吸附侵染过程。关键词：噬菌体；大肠杆菌；宿主；侵染噬菌体（Bact

2、eriophage）是一类专性寄生的原核生物病毒，分布广泛于土壤、空气、水中或生物体内。根据噬菌体与宿主细胞的关系可分为烈性噬菌体（virulentphage）和温和噬菌体（temperatephage）两大类[1]。噬菌体对发酵工业危害巨大[2-4]，本文以λ噬菌体为模式病毒，研究几种外界因素对噬菌体侵染宿主规律的影响。1材料和方法1.1.材料1.1.1菌种：E.colik12Sgal-（简称负菌）、E.colik12F2gal-/λgal+/λ（简称正菌）1.1.2　培养基及缓冲溶液液体肉汤培养基：牛肉膏0

3、.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，pH7.2上层半固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂0.6%，pH7.2下层固体培养基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，氯化钠0.5%，琼脂1.8%，pH7.2加镁磷酸缓冲液：KH2PO42g,K2HPO47g,MgSO4.7H2O0.25g,蒸馏水1000mL1.2.方法1.2.1λ噬菌体裂解液的制备[5]液体肉汤培养基将正菌活化18h，离心收集菌体，缓冲液洗涤，紫外线照射10s～15s，黑暗培养3h，加入0.4mL氯仿剧烈振荡30s～60s

4、，静止5min。离心（4000r/min）15min,上清液分别移入试管中,此液即为λ噬菌体裂解液。再次侵染负菌得到噬菌体富集液。_________________作者简介：吕玉红，女，2003级生物工程专业本科生，大学生创业基金资助。通讯作者：王丽丽教授，电话：0311-88632172E-mail:wanglili@hebust.edu.cn1.2.2噬菌体效价的测定采用双层平板法，将下层固体培养基倒平板凝固为底层平板，液体肉汤培养液将噬菌体裂解液10倍稀释至10-7，5mL融化的上层半固体培养基冷却至45

5、℃左右，分别加入0.5mL负菌敏感菌液，同时加入0.2mL不同稀释度的噬菌体裂解液，迅速倾于底层平板上，轻轻摇匀，待凝固后，置37℃培养24h。统计平板上形成的噬菌斑数量，并计算其效价（噬菌体个数/ml）。2结果与分析正菌菌株是整合λ噬菌体的溶源性大肠杆菌，负菌菌株的λ噬菌体整合能力缺失，因此正菌菌株经紫外线诱导后裂解的λ噬菌体，对负菌菌株则表现为烈性噬菌体的侵染效果。2.1紫外诱导大肠杆菌正菌裂解噬菌体的效价经紫外诱变，正菌被裂解形成的噬菌体裂解液效价为：2.743×107个/mL经负菌扩增得到的噬菌体富集液

6、的效价为：1.097×109个/mL图1大肠杆菌的噬菌斑图1大肠杆菌的噬菌斑2.2大肠杆菌的生理状态对噬菌体侵染的影响噬菌体在固体平板上侵染宿主能够形成基本固定大小的噬菌斑，一般12h左右噬菌斑直径大小不再扩展，说明噬菌体对宿主的侵染是有限制的，这种限制是否与大肠杆菌的生理状态有关？将大肠杆菌负菌接种于液体肉汤培养基中，并等分到8个三角瓶中，37℃摇瓶培养，并每隔2h，取出一瓶接入稀释的噬菌体，,同时无菌培养基接入噬菌体为对照，继续培养到30h，分别稀释后双层平板法观察噬菌体数量，结果见表1。以对照的噬菌斑结果

7、为阴性结果，则表1显示出前12h噬菌体能够良好侵染宿主，而这个时期正是宿主的快速分裂期，12h后宿主进入稳定期，侵染力也随之丧失，充分说明了噬菌体对宿主的侵染与宿主的生理状态有关，这与固体平板上噬菌斑长到一定大小时不在扩展的结果是一致的。接入时间/h246810121416平板上噬菌斑的情况++++++++++++++++++++++--表1生理状态对噬菌体侵染的影响注：+++代表噬菌斑数大于300，2.2pH对噬菌体侵染的影响配制不同pH的上层半固体肉汤培养基，45℃水浴保温，分别加入0.5mL的敏感菌液，同

8、时加入0.2mL的噬菌体稀释裂解液，摇匀后，双层平板观察噬菌斑生长情况。表2pH对噬菌体侵染的影响pH5.06.07.08.09.0噬菌斑生长情况-+++++++-注：+++代表噬菌斑数大于300++代表噬菌斑数大于200–代表无噬菌斑生成表3结果表明pH6.0～8.0时，大肠杆菌生长良好，同时也适合λ噬菌体的侵染。2.3敏感菌的数量对噬菌体侵染造成的影响取6支已灭好菌的半固体肉汤培养