本科毕业论文--日本囊对虾微卫星引物的筛选与条件优化研究

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1、日本囊对虾微卫星引物的筛选与条件优化研究生物工程06-2李亚菲指导教师：董世瑞内容摘要：对日本囊对虾微卫星引物进行筛选，采用三级筛选的方法。首先利用降落PCR确定引物退火温度的范围，其次利用梯度PCR确定引物退火温度，然后采用正交试验设计方法和单因素优化进行PCR反应体系中Mg2+、dNTPs、引物浓度三个因素的优化，Mg2+对扩增效果影响的显著性最大，建立最优的扩增体系。PCR产物通过8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染色的方法进行检测。量化分析结果表明，在10μl反应体系中，Mg2+、dNTP

2、s、引物三个参数的最适浓度分别为1.2μl25mM/LMg2+，0.8μl10´dNTPs，0.8μl10´SSR引物。关键词：日本囊对虾；微卫星；PCR1导言1.1日本囊对虾简介日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)是一种前景发展较好的养殖品种，广泛分布于印度、澳大利亚、红海、坦桑尼亚、菲律宾到日本的东南沿海，我国江苏以南沿海也有分布，现已成为我国南、北方重点养殖的主要对象。日本囊对虾对水温的要求介于斑节对虾(Penaeusmonodon)和中国明对虾(Fenneropenaeu

3、schinensis)之间，日本囊对虾生长速度快、对环境适应能力好，抗病能力也较中国对虾、斑节对虾等养殖虾类强。1.2PCR技术聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性→退火→延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或

4、经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性→退火→延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～

5、4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应体系：1、引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物浓度一般为0.1～0.5μM，这一引物浓度足以使1kb的DNA片段在PCR反应体系中循环扩增30T。以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会，但浓度过低则得

6、不到产物或产量过低。2、Taq酶：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，但保真度较差，在复制比较长的模板时容易发生点突变。另一种为在大肠杆菌合成的基因工程酶。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5’→3’方向逐个将dNTP分子连接到引物的3’端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无3’→5’的外切酶活性，没有校正功能。催化一典型的PCR反应约需酶用量一般为0.5～5U/100μl，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3、dNTP

7、：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。多次冻融会使dNTP降解，一般存储浓度为10mM，小量分装，-20℃冷冻保存。在PCR反应中，dNTP浓度一般为50～200μM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。高浓度dNTP可加速反应，但同时会增加错误掺入和实验成本；低浓度dNTP可提高PCR的精确性，但反应速度和PCR产物的产量会降低。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4、模板：就模板而言，影响P

8、CR的主要指模板的数量和纯度。一般PCR反应中模板的数量为102～105个拷贝，灵敏的PCR甚至可从一个细胞、一根头发、一个孢子或一个精子提取的DNA中分析目的序列。模板的纯度一般要求不是很高，某些扩增实验中甚至将裂解液直接作为PCR模板。但模板中不能有影响扩增反应的物质存在，如蛋白酶、核酸酶、尿素、SDS、EDTA、卟啉类物质等，上述物质的存在会影响扩增效果，甚至使扩增失败。模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。一般对于单拷贝的哺乳