麻栗坡兜兰 ISSR 引物筛选及反应体系的优化.pdf

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1、安徽农业科学，JournalofAnhuiAgri．Sci．2014，42(20)：6553—6555责任编辑李占东责任校对李岩麻栗坡兜兰ISSR引物筛选及反应体系的优化高丽霞(河池学院化学与生物工程学院，广西宜州546300)摘要[目的]对麻栗坡兜兰ISSR引物进行筛选，并建立一个稳定性高、重现性好、适合麻栗坡兜兰ISSR反应体系。[方法]以麻粟坡兜兰DNA为模板，分别对Mg2、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶、DNA等PCR反应成分进行优化，并用优化的体系对25条兰科中报道的【ssR引物进行筛选。[结果】确立了麻栗坡兜兰最适ISSR—PcR反应

2、体系：在25l反应体系中，M2mmol／L、引物0．4mmol／L、dNTP0．20mmol／L、DNA1．5、zl叼酶1．4U。利用该体系，共筛选得到10条ISSR引物用于麻粟坡兜兰分析，并对21份麻栗坡兜兰材料进行扩增，获得了较好的扩增效果。[结论]该体系稳定可靠，为今后ISSR标记在兜兰属植物的种质鉴定、遗传多样性等方面的广泛应用奠定了重要基础。关键词麻栗坡兜兰；ISSR—PCR；体系优化中图分类号S188文献标识码A文章编号o5l7—6611(2014)20—06553—03SelectionofISSRPrimersandOptimizat

3、ionofReactionSysteminPaphiopedilummalipoenseGA0Li-xia(ChemicalandBiologicalEngineeringcollege，HechiUniversity，Yizhou，Guangxi54630o)AbstractlObjective1ISSRprimerswereselectedandPCRsystemwasoptimizedinordertoestablishISSRreactionsystemwithhighstabili—tyandgoodreproducibility．[Met

4、hod]Usingsingle·factortest，Mg“，dNrP，primerconcentration，TaqDNApolymeraseandDNAdosagewereoptimized．Usingtheoptimizedsystem，primerswerescreenedoutof25primers．1ResultlTheoptimizedreactionsystemwasasthefol—lowing：ina25lreactionsystem，10×PCRBuffer2．5Ixl，Mg“2mmol／L，theprime~0．4mmol／L

5、，dNTP0．20mmo~L，DNA1．5andTaqenzyme1．8U．Usingthissystem．10primemwerescreenedand21materialsofPaphiopedilummal~oemewereamplified．Thepro．filewasclearandthepolymorphismwashigh．IConclusionIThesystemwasstableandreliable，andlaidanimportantfoundationforwideap—plicationoftheISSRmarkerinth

6、epocketorchidgenusplantidentification．geneticdiversityforthefuture．KeywordsPaphiopediluremalipoense：ISSR—PCR：Systemoptimization麻栗坡兜兰(Paphiopedilum，础oense)属兰科(Orchi—因子优化试验，建立适用于麻栗坡兜兰的ISSR．PCR反应体daceae)兜兰属(Paphiopedilum)地生兰或半附生兰。麻栗坡系，利用该体系对从兰科中检索到的25条ISSR引物进行筛兜兰是兜兰属现存种类中最原始的类型，代表

7、了由杓兰属向选，为进一步研究麻栗坡兜兰遗传多样性奠定基础。兜兰属过渡的种类⋯，主要分布于云南东南部、广西西部、贵1材料与方法州西北部，以及越南北部。一方面由于近年来的过渡采摘，1．1试验材料供试材料为麻栗坡兜兰，采自木论国家级另一方面由于其自身的生物学原因，它没有像硬叶兜兰和杏自然保护区的自然居群。黄兜兰那样延长的地下根状茎，是当前最需要保护的濒临1．2试验方法物种之一。1．2．1DNA的提取。取新鲜带叶兜兰的嫩叶，经研磨后，按MURRAY等的CTAB法提取叶片总DNA[10]。ISSR分子标记技术已在兰科中得以广泛应用。赵谦等用l4条ISSR引物分

8、析了l4个蝴蝶兰品种间的遗传关1．2．2ISSR分析。ISSR引物由上海生工生物工程有限公司合成，参照高丽等