毕业设计（论文）-PPT答辩-脂质体介导的CHO细胞转染

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1、脂质体介导的CHO细胞转染——脂质体介导的基因真核细胞转染指导老师：班级：生物2班姓名：一内容简介二实验材料三实验方法四实验结果分析五结论一内容简介转染就是让外源核酸进入真核细胞中。如今广义的转染不单包括了DNA、RNA，还有蛋白质等生物大分子。核酸转染技术在21世纪60年代末和70年代初期已经建立。常用的转染方法有:磷酸钙法、DEAE一葡聚糖法、电穿孔法(电击基因导人法)、脂质体转染法，另外还有细胞核的直接微注射法、Pol沙rene介导的外源DNA导入培养细胞可分为瞬时转染和稳定转染。本实验将采用脂质体转染法转染宿主细胞。Lipofectamine™2000转染试剂是一种阳离子

2、脂质体,在体外可以转染许多种哺乳动物细胞，对各类细胞系都可提供最高的转染效率，具有高效性和操作步骤简单的优点。影响阳离子脂质体转染细胞转染效率的因素1.被转染细胞脂质体复合物越易进入细胞，基因转染效率就越高。转染前细胞最好经过1次传代，以保证细胞生长旺盛，容易转染。贴壁细胞生长到活率为80%时就要进行下一次传代，否则细胞就会出现接触抑制，从而降低细胞转染活力。转染时细胞密度对转染效率影响非常显著。不同的转染试剂，要求转染时的最适细胞密度相同2.培养基种类不同的细胞类型有不同的特性，需要特定培养基、血清、补充添加剂等。3.转染混合物中DNA与阳离子脂质体的量阳离子质脂体具有细胞膜活

3、性，因此可能对细胞膜或亚细胞结构的膜结构的完整功能产生影响，从而形成细胞毒性。体外转染中，优化的比率常常大于1，而体内转染时其比率接近1较好。二实验材料1.细胞系中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)2.试剂脂质体LipofectaminerM2000；G418；台盼蓝，储存浓度4％，使用浓度0．4％；固定液：4％多聚甲醛甘氨酸漂洗液：IOOmM／L，用DPBS配制冲洗液：DPBS，每升溶液中含CaCl2O．109、KCl0．209、MgCl2·6H20O．109，NaCl8．009、Na2H·711202．169调节pH7．4，4“C保存。封闭液：5％正常山羊血清抗荧光淬灭封片剂3.药

4、品青霉素、链霉素；胎牛血清；③D-Hank’s：每升溶液中含NaCI89、KCl0．49、Na2HP040．069、l(IL]2P040．069、NaHC030．359。④双抗：以PBS或D-Hank‘s配制，过滤除菌；抗体稀释液；抗PrP单抗BEl2；羊抗小鼠IgG。4.培养基DMEM培养基，无血清opti．MEM，Gibeo5.实验仪器①细胞用倒置显微镜②医用超净工作台③C02细胞培养箱④OliymptB倒置荧光显微镜；激光共聚焦扫描显微镜(FV500)⑤超低温冰柜：．80CULTFreezer702⑥高速离心机⑦冷冻台式离心机⑧全自动高压锅⑨DK．8D电热三相恒温水槽三实验

5、方法（一）CHO细胞制备1.CHO细胞简介CHO细胞是中国仓鼠卵巢细胞，是目前生物工程上广泛使用的细胞系。其细胞结构和培养特性与微生物细胞相比，有显著差别：动物细胞比微生物细胞大得多，无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染，培养时需用抗生素；培养过程需氧量少（氧传质系数kla大于10h-1即可满足每毫升107个细胞的生长）；培养过程中细胞相互粘连以集群形式存在；原代培养细胞一般繁殖50代即退化死亡；代谢产物具有生物活性，生产成本高，但附加值也高。2.DMEM培养基组成将一袋培养基全部倒入一容器中，用少量注射用水将袋内残留培养基洗下

6、，并入容器。加注射用水（水温20~30℃）到950毫升，轻微搅拌溶解。加入2.438克碳酸氢钠轻微搅拌溶解，加注射用水至一升用1molL氢氧化钠溶液或1molL盐酸溶液调ph至所需值用0.2um滤膜正压过滤除菌溶液应在2℃~8℃下避光保存3.培养皿处理玻璃器皿一般需用清洁液浸泡1~7天，清水冲洗20次后再用蒸馏水洗两次，烤干备用。用前160℃高温消毒2小时后使用。96孔或24孔塑料板一般用2﹪NaOH浸泡4小时后，清水洗净再用1NHCL浸泡4小时，用清水冲洗后再用蒸馏水漂洗，37℃干燥后，紫外线灯照射消毒。新橡皮塞须用1/2NAOH煮沸15分钟，洗后再用4﹪HCL煮沸15分钟

7、，清水冲洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10分钟灭菌，或送高压锅灭菌。4.CHO细胞培养将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。5.CHO细胞无血清驯化取处于对数生长期的贴壁CHO细胞，活率大于95﹪，转瓶中开始进行无血清驯化。将无血清细胞培养基和原培养基按1:1（V/V）的比例进行混合，接种密度为2×105cells/ml的细胞，在37％、5％CO2培养箱进行培养。根据细胞生长和活率情况，在降血