ELISA检测抗体

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1、第四次试验ELISA法血清抗体检测免疫胶体金法检测早早孕免疫学教研室※重点实验※(写实验报告）&血清抗体的检测：第一周：免疫小鼠（腹腔注射5%绵羊红细胞SRBC)、EILISA板抗原包被以及封闭第二周：小鼠眼球取血分离血清(96h后已经产生特异性抗体，存在血清中）第四周：ELISA实验检测血清中抗体水平（ELISA后续步骤）成绩课堂表现及出勤情况，占5分实验报告，占10分期末考试，占10分复习第一次课操作SRBC冻融稀释（得到比例适当的抗原，非完整的红细胞）↓每孔加包被液（碳酸盐缓冲液，含抗原）100μl,37℃1h（包被）↓弃去孔中液

2、体，用PBS洗板3次，每次均拍板↓加封闭液，每孔200μl，37℃，30min（封闭）↓弃去孔中液体，用PBS洗板3次，排干后4度保存包被和封闭ELISA板（复习）包被和封闭是ELISA前两个步骤，第一次课已经完成。包被就是将已知抗原或抗体非特异性，物理性吸附于固相载体表面并保持其免疫学活性。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。洗涤：不论是包被还是封闭后，我们都用PBST洗液洗涤三次，目的是去除游离的未结合的物质，从而保证试验结果的特异性及稳定性。阳性阳性阴性待测一阴性待测一待测二待

3、测二1待测一本组待测血清样本1:20稀释，待测二邻组待测血清样本1:20稀释。21:20稀释50μl待测血清+950μlPBS3每孔加对应液体（注意混匀）100μl，阳性孔和阴性孔分别加入100μl的阳性、阴性对照液。加不同液体注意更换枪头，不要串孔。并做好标记5统一放入37度孵箱1h（大于1h)ELISA步骤包被↓封闭↓加入待测样本↓加入酶标二抗↓加入底物↓加入终止液，终止反应加入酶（HRP）标记二抗1弃液2用PBS洗板3次，200μl/每孔，每次一分钟以上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板，拍干。3于8个ELISA孔中

4、加入酶（HRP)标记二抗，100μl/每孔。4加完后统一放入37度温箱1h(大于1h)。加入底物-酶促反应-反应终止1弃液2用PBS洗板7次，200μl/每孔，每次一分钟以上，水平轻微晃动，切勿串孔、溢出。每次洗完用滤纸拍板，拍干。3于8个ELISA孔中分别加入底物100μl/每孔。4加完后，室温避光反应10min。5反应10min后，于8个ELISA孔中分别加入终止液，50μl/每孔。标记抗体技术是在抗体球蛋白分子上，连接某一个特定的、容易检测的分子或原子(标记物)，利用标记抗体能与相应抗原结合的特性，通过标记物的检测，从而确定抗原的存

5、在部位。标记抗体技术目前广泛应用的主要有荧光抗体、酶标记抗体和同位素标记抗体等。此外尚有铁蛋白标记抗体，主要用于免疫电镜的技术，在亚细胞水平上进行抗原定位。基本类型放射性核素标记技术免疫荧光技术免疫酶技术1.免疫荧光技术即免疫荧光细胞组织化学技术，是根据抗原抗体反应的原理，采用荧光素标记的已知抗体作为探针，检测待测组织、细胞标本中的靶抗原，形成的抗原-抗体复合物上带有荧光素，在荧光显微镜下，发出明亮的荧光，这样就可以分辨出抗原（或抗体）的所在位置及其性质，并可利用荧光定量技术计算抗原的含量，以达到对抗原物质定位、定性和定量测定的目的。分为

6、直接法、间接法、补体法、双重免疫荧光染色。方法1、直接法：这是最早的方法。其基本原理是用已知的抗体标记上荧光素后成为特异性荧光抗体，染色时将该抗体直接滴在载玻片上进行孵育，使之直接与载玻片上的抗原结合，在荧光显微镜下直接观察，作出判断。该方法评价：简单易行、特异性高、快速方便，常用于肾活检组织几种免疫球蛋白的检测和病原体的检测。但其不足是只能检测相应的一种物质，敏感性较差，效果有时不理想，目前较少作为更多方面的检测。2、间接法：该法的基本原理是用特异性的抗体与切片中的抗原结合后，继用间接荧光抗体，与前面的抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧

7、光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的抗原。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。目前本法应用较广泛，只需制备一种种属荧光抗体，即可适用于多种第一抗体的标记显示。方法3补体法：是间接法的改良。它是采用特异性抗体同新鲜补体混合后再与切片上的抗原反应，补体就结合在抗原-抗体复合物上，再用抗补体的荧光抗体与补体结合，形成抗原-抗体-补体-抗补体荧光抗体复合物。这种方法不仅具有间接法的敏感性，而且荧光抗体不受免疫血清的动物种属限制，一种荧光抗体就能检测所有的抗原抗体系统；缺

8、点是较间接法更容易出现非特异性染色，且补体不稳定，每次均要采取新鲜血清，操作上比较麻烦。4双重免疫荧光染色：即可在同一标本上定位定性检测两种抗原。如A抗原的抗体用荧光素罗丹明标记，呈橘红色，而