犬细小病毒的基因组克隆和生物学特性研究及狂犬病病毒N基因的原核表达

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1、中国农业大学博士学位论文犬细小病毒的基因组克隆和生物学特性研究及狂犬病病毒N基因的原核表达姓名：贺英申请学位级别：博士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张曼夫20061101接种CPV和Tf孵育发现，TfR是CPV病毒组织特异性的原因，但也有其它因素影响CPV在不同组织细胞的复制。根据获得序列设计4对SiRNA寡聚核苷酸，构建psiSTRIKE系列的U6发譬结构载体，研究质粒介导的siRNA对CPV病毒复制的影响。结果显示，分别以CPV的核衣壳蛋白基因和非结构蛋白基因为靶基因，选择的4段21at的保守序列，构建了小发夹RNA(shorthairpinRNA，

2、shRNA)的psiSTRIKE表达载体，并转染FKSl细胞筛选稳定的转染细胞，通过病毒感染检测、细胞活度测定和TCIDso测定，发现该种方法介导的shRNA表达质粒能抑制CPV病毒在细胞内的复制和感染，具有抗病毒作用，但不能完全阻断病毒的感染。第二部分：狂犬病是由狂犬病毒引起的中枢神经系统的人兽共患传染病，一旦发病无法救治，100％死亡。狗是最主要的宿主，而且也是感染人与其它动物的主要传播媒介；目前尚无有效的治疗方法，疫苗接种是预防狂犬病的唯一有效途径。家养和野生动物接种疫苗并保持较高的抗体水平是预防和控制狂犬病的最有效途径，因而对家养和野生动物狂犬病免疫后

3、中和抗体效价的监测就显得尤为重要。以本实验室已构建和保存的质粒pGEM-T／NP(CTN)为基础，将N基因亚克隆到表达载体pMAL-c2x中，构建了原核表达质粒pMal．NP，转化大肠杆菌JMl09细胞诱导其表达。Western印迹和ELISA验证了表达纯化的MBP．NP融合蛋白的抗原性和免疫原性。利用此融合蛋白作为包被抗原，构建了一个检测血清中抗狂犬病抗体水平的间接ELISA检测体系，通过测定标准阴性血清、阳性血清和采自免疫接种过狂犬病疫苗的犬科动物的抗体水平，表明该ELISA方法敏感性高，特异性好。测定样品ELISA的OD值与标准方法RFFIT测得的中和抗

4、体滴度两者具有很高的相关性(r=O．9436)。安全方便的重组MBP—NP融合蛋白能够用于检测犬科动物的抗狂犬病抗体水平和免疫原。关键词：犬细小病毒；基因组克隆；亚细胞定位；转铁蛋白受体；siRNA干扰；狂犬病病毒；N基因；原核表达nSummaryTherearethreesectionsinthisdissertation：1)Genomecloneandstudyonbiologicalcharactersofcanineparvovirus；2)Expressionofthenucleoproteingeneofrabiesvirusforuseasad

5、iagnosticreagentSectiononeCanineparvovirus(CPV)emergedasapathogenofnewacutehemorrhagicentericandmyocardialdiseaseindogs．Thenewinfectiousdiseasewithahi曲rateofmortalitywasobservedinpupsandCPVwasanimportantpathogenofdogs．Parvovirushasalinearsingle-strandedDNA(ssDNA)genome5kbinlengthwit

6、hhairpinstructuresatbothends．ThevirushastwomajorORFs，oneencodingthetwononstructuralproteins(NSlandNS2)，theotherencodingthecapsidproteinsVPlandVP2．TheB2004strainofcanineparvoviruswasisolatedfromasteeleofsampleinfecteddoginChinabyblindpassageinFK81cellandidentifiedusingacanineparvovim

7、santigentestkit．ViralgenomewasextractedfrominfectedcellsusingviralgenomeextractionKit(v-gene)accordingtothemanufacturer'sinstructions．TwopairsofprimersetsforPCRworedesignedfromreportednucleotidesequencesforgenomeofthecanineparvovirusinGenbauk．TwoDNAsectionswasclonedintoplasmidspMDl8

8、-Tandsubsequentlyna