犬瘟热病毒h基因克隆测序和原核表达

《犬瘟热病毒h基因克隆测序和原核表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、莱阳农学院硕士学位论文符号说明简写CDCDVOPMV符号说明英文全称caninedistemper中父犬瘟热caninedistempervirus犬瘟热病毒0nderstepoon犬瘟热病毒的常用疫苗株measlesvirus麻疹病毒vemcellAfricallgreenmonkeycell非洲绿猴肾细胞ORFnmDNAcDNARNAELISAPCRRTopenreadingfragment开放阅读框nanOmeter纳米deox蜘bonucleicacid脱氧核糖核酸ComplementaryDNA互补DNAribonucleicacidEn珂ome—linkedimmunosorb

2、entassaypolymerasechainreactionreVerSetranscriptRrr-PCRreVerSetranscriptiVe—PCR0DRNasindNTPAmpKDopticaldensityRibonucleaseInhibitor核糖核酸酶联免疫吸附试验聚合酶链式反应逆转录反转录一聚合酶链式反应吸光度RNA酶抑制剂deoxyribonucleosjdetriphosphate脱氧核糖核苷三磷酸Ampicillin(kilo)Dalton氨苄青霉素(千)道尔顿莱IjI=i农学院硕十学位论文符号说明bpntULBHRPrpmCPEEDTARNaseTETmEBl

3、PTGbasepairnucleotideunlt碱基对核苷酸单位Luria．BertaniMediumLB培养基Horseradishperroxidase辣根过氧化物酶rOtatlOnpermmutecytopathiceffect转

4、龠细胞病变ethylenediaminetetraacetate乙二胺四乙酸ribonucleasetris／EDllAbufrermeltingtemperatureethidiumbromide核糖核酸酶TE缓冲液熔解(变性)温度溴化乙锭isopropyl．D．D．thiogalactoside异丙基硫代-D-D一半乳糖苷M(m01／L)mole／1

5、iteoSDSPAGE摩尔浓度sodiumdodecylsulfat十二烷基磺酸钠P01yacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS—PAGESDs—Pol”crylamidegelsDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳electrOphOresisx．gal5-bromo．4一chloro．3一indoly—p—D唱a15一溴一4一氯一3一吲哚一D—D一半actoside乳糖苷莱阳农学院硕士学位论文摘要犬瘟热病毒H基因克隆测序与原核表达摘要1．将犬瘟热病毒弱毒株接种Vero细胞观察细胞病变，将细胞反复冻融三次收获病毒，并对病毒增殖纯化。根据GenBank中已发表

6、犬瘟热病毒Onderstep00rt弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列，设计合成了一对能扩增1074bp基因片段的引物，引物两端有sall和xhoI酶切位点。以病毒RNA为模板，用RT—PcR方法，扩增出1074bpH基因。将扩增得到的部分H基因克隆到pMDl8一T载体上，经蓝白斑和酶切鉴定筛选出阳性克隆进行序列测定，用blast工具将其与GeneBank上标准株代表毒株序列进行了比较。结果表明：该基因与标准株代表毒株序列完全同源，同时与疫苗株Onderstepoort、convac株和国内外cDV病毒分离株进行了序列分析和同源性比较。结果显示目前使用的cDV弱毒疫苗株H基因的核苷酸和编码氨基

7、酸与国内和日本犬瘟热病毒分离株同源性比较低，与扬州分离株同源性为90．6％，长春分离株为91．3％，新疆分离株为90．5％，日本分离株D85755为91％；与Onderstepoort、convac株、美国分离株98—2666—2同源性较高，分别为97．7％、97．2％、98．1％，与国内、日本分离株存在明显的差异。上述结果表明，cDV在传代过程中由于受生态环境、不同动物之间互相传播等因素的影响，引起了野毒株的变异，cDV疫苗株不能对所有的cDV流行株产生有效的保护。2．对克隆载体pTH做salI和xhoI双酶切，将所得片段以正确阅读框架插入pET一32a(+)载体，构建了重组质粒pETH

8、。重组质粒经PCR和酶切鉴定为阳性后，转化八宿主菌zcD，，BL21(DE3)。IPTG诱导表达，经sDs—PAGE分析表明，在64KD处出现了与预期大小相符目的条带。确定了最佳诱导表达条件，IPTGl．0】TlM、25℃、Amp浓度100峭／ml、诱导表达6h。经western—blot免疫印迹试验进一步证实，该基因获得了正确表达。对表达蛋白做可溶性分析，证实该蛋白以沉淀包涵体形式存在，并对包涵体进行纯化得到目的蛋白。