《CR技术及应用JYH》PPT课件

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1、PCR技术及应用分子生物学诊断组江杨华2016年3月25日星期五PCR的定义PCR的原理PCR反应体系的的成分及其作用PCR反应体系的优化PCR技术的特点PCR产物的检测方法PCR技术在临床检验中的应用一、PCR的定义PCR（polymerasechainreaction)：聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增DNA片段的技术。PCR技术是由美国的KaryMullis于1985年发明，用此方法可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。由于PCR方法带来的革命性作用，KaryMullis本人因此获1993年诺贝尔化学奖。二、PCR技术的原理PCR技术，其原理是模

2、拟天然DNA的复制过程：以拟扩增的DNA分子为模板，在DNA聚合酶的作用下，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的引物（寡核苷酸片段）引导下，按照半保留复制的机制合成新的子链DNA的过程，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到不断的扩增。二、PCR技术的原理PCR反应主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。1.变性(Denaturation)：加热使模板DNA双链碱基间的氢键断裂而形成两条单链的过程。温度一般为90-95度。2.退火(复性)(Annealling):温度降低后，变性后的DNA与引物按碱基配对原则互补结合的过程。温度一般为Tm-5度。二、PCR技术的原理3.延伸(Extension

3、):在适宜温度下，在DNA聚合酶作用下，以4种dNTPs等为原料，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链的过程。耐热DNA聚合酶最适温度为72℃。上述3步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过35个循环后，理论上DNA的量可达到235倍。PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CPCR的指数扩增（2n）引物5’5’3’3’第一次循环第二次循环第n次循环二、PCR技术的原理1.缓冲液：10～50mMTris-Cl(pH8.4)：维持Taq酶作用环境的偏碱性25～50mMKCl：促进引物退火，>50

4、mM会抑制Taq酶的活性。100μg/ml牛血清白蛋白(BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇(DTT)也有类似作用。三、PCR反应体系的的成分及其作用2.MgCl2：Taq酶具有Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，浓度一般为1.5～2.0mM，浓度过高能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。3.dNTPs:dATP、dGTP、dCTP、dTTP。浓度一般为0.05～0.2mM。过高能加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和室验成本。过低则反应速度下降，但可提高实验的精确性。三、PCR反应体

5、系的的成分及其作用4.引物(Primer)：是一段寡核苷酸片段，即预扩增核酸片段两端的已知序列。浓度一般为0.2～1uM，偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。5.TaqDNA聚合酶：耐高热，最初从火山口细菌中提取，具有连接酶活性和5’端至3’端的外切酶活性。目前市售的均为克隆表达产物。三、PCR反应体系的的成分及其作用6.模板DNA(Template):可以是DNA，也可以是RNA，RNA的扩增首先需逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。待扩增的核酸需部分纯化，使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。模板

6、的量一般微克水平或102～105拷贝，过高会引起非特异产物的增加；过低则产量降低。7.水：去离子水，补足整个反应体积。三、PCR反应体系的的成分及其作用10×buffer：1×30/10=3μlMgCl2:1.5×30/25=1.8μldNTPs:0.2×30/10=0.6μl引物P：0.4×30×2/10=2.4μlTaq酶(5U/μl)：1/5=0.2μl模板：1μl水：30-3-1.8-0.6-2.4-0.2-1=21μlPCR反应体系：30ul四、PCR反应条件优化：1、温度、循环参数：⑴变性温度和时间：保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键。加热90～95℃，30～60

7、s，再复杂的DNA分子也可变性为单链。根据模板DNA复杂程度，可以调整变性温度和时间。一般情况下选择94℃30″，可使各种复杂的DNA分子完全变性。温度过高或高温持续时间过长，可对Taq酶活性和dNTP分子造成损害。四、PCR反应条件优化：⑵复性温度和时间：PCR扩增特异性取决于复性过程中引物与模板的结合。复性温度的选择，可根据引物的长度和G+C含量确定，长度在15～25bp之间时，复性温度Tm=