《CR技术及其应用》PPT课件

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1、第八章PCR技术及其用PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热D

2、NA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖94℃55℃37℃PCR仪PCR仪1.PCR技术的原理PCR反应是模仿细胞内发生的DNA复制过程进行的，在体外由酶催化合成特异性DNA片断。这种方法以DNA互补链聚合反应为基础，通过DNA变性、引物与模板一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，获得待扩增的特异DNA片断。第一节PCR技术原理和工作方式2.PCR的扩增步骤模板DNA变性引物DNA复性引物DNA延伸DenaturetemplateDNAbyheat(95

3、oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequencesTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引

4、物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporatedTargetSequenceTargetSequencePrimer1Primer25’3’5’5’3’5’3’3’TaqDNAPolymerase③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。TargetAmplificationNo.of

5、No.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconPCR的反应程序P137（1）第一步预变性（denaturation）90-96oC下几十秒至几分钟，模板DNA双链完全变性成单链（2）第三步复性（annealing）40-65oC下1分钟，引物优先与模板复性。①引物的浓

6、度高②引物的链短（2）第二步变性（循环）90-96oC下几十秒90-96oC下1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。（4）第五步变性（denaturation）70-75oC下1-2分钟，TaqDNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。（3）第四步延伸（extension）（5）第六步重复（repeat）第二步——第三步——第四步复性延伸变性95oC5min50oC1min72oC2min94oC1min温度循环PCR1.Buffer3.PCR反应体系任何一个生物化学反应都在一定的缓冲体系中进行，提供pH缓冲能力和有助于反应进行的成分Tris.HclpH8.3-9.0Mg2+Mn2+扩增特

7、异性和产率PCR反应体系2.dNTPsdNTPs:dATPdTTPdGTPdCTP扩增产量、特异性和保真度3.PrimerPCR反应体系引物是PCR过程中引导互补链DNA合成的一种脱氧核苷酸寡聚体与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（5‘端相同）的短DNA。①位置TCAGATCCAGTCTAGG5’3’3’5’AGTCATCC②引物的长度一般引物设计为长16—30bp引物长，特异性高引物短，