几种禾本科牧草遗传转化体系的建立和抗虫转基因研究

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1、几种禾本科牧草遗传转化体系的建立和抗虫转基因研究李达旭博士学位论文四川大学2006四川大学博士学位论文印如基因启动子LQZ，构建了ppip基因的原核表达载体，实现了PPip基因的原核表达。实验结果表明，大肠杆菌细胞膜上的酶系统不能识别印功基因蛋白的信号肽，从而导致杀虫蛋白的信号肽不能正常切除，因此含有信号肽序列的印功基因表达产生的杀虫蛋白没有杀虫活性，而不含信号肽的刀印基因则能表达有杀虫活性蛋白质。类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因在大肠杆菌中表达成功，不仅可以拓宽该杀虫蛋白的应用范围，而且有利于进一步研究该杀虫蛋白基因的结构

2、，包括启动子序列，信号肽序列，密码子偏爱性等，为该基因的遗传改造，增加表达量，增强杀虫效果以及进一步的转基因研究打下基础。2．类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(pp硒)在烟草中的表达由于融合表达的类产碱假单胞菌杀虫蛋白没有杀虫活性，因此本研究将以pC,蛳B!A2301为母载体，构建不含信号肽的ppip基因双子叶植物表达载体，并通过根癌农杆菌介导，将ppip基因转化到烟草的基因组中，进一步认识刀劫基因转入高等植物基因组后的表达特性。实验结果显示，ppip基因在烟草基因组中能够表达，并产生有杀虫活性的蛋白质。通过印如基因在原核生

3、物和高等植物中的表达研究证实，来自于原核生物的不含信号肽的ppip基因，在高等植物中能够由CaMV35S启动表达，产生有杀虫活性的蛋白质。二)．转化禾本科牧草的表达载体的构建以pCAMBIAl304为母载体，经过Ncol和BSTEII双酶切，切除gus和mgfp标记基因，避免与杀虫蛋白基因一起产生融合蛋白而影响杀虫蛋白的活性。然后克隆不含信号肽的类产碱假单胞菌基因(PP印)，将其连接到双酶切后的pCAMBIAl304载体的启动子CaMV35S后，从而构建类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因的单子叶植物表达载体pCAMBIAl30

4、4--ppip，用于后期的转基因研究。三)．川草二号老芒麦和短芒披碱草遗传转化体系的建立和基因转化的研究1禾本科牧草愈伤组织再生体系的建立外植体来源，光照条件和植物生长调节剂组合等是影响愈伤组织诱导和植株再生的主要因素。本研究以牧草种子的成熟胚、下胚轴和幼叶为外植体，MS四川大学博士学位论文(MurashigeandSkoog)为基本培养基，添加2，4一二氯苯氧乙酸(2，4-D)、NAA、6～BA和激动素(KT)，进行愈伤组织的诱导，其中成熟胚的出愈率最高，达到85％以上。研究表明，愈伤组织诱导的最适培养基为MS培养基

5、，最佳的激素组合为2，4一D5．Omg／L和Kinetin(KT)0．05mg／L。不同外植体来源和不同激素组合及浓度将产生不同类型的愈伤组织，其中黄白色，颗粒状易脆裂的愈伤组织才能够再生植株，而水样无明显结构的愈伤组织则只能诱导生根，不能再生出植株。在愈伤组织的诱导和继代培养时，添加一定数量的水解酪氨酸，可以改善愈伤组织的质量，提高愈伤组织的分化能力。最佳的分化培养基是1／2MS培养基，最佳的激素组合川草二号老芒麦为KT2．0mg／L和NAA0．5mg／L，短芒披碱草为6-BA2．0mg／L和NAA0．5mg／L。从

6、成熟胚诱导的愈伤组织分化能力最强，其再生频率达到54％以上。绿色植株在生根培养基中培养约6周，可诱导出大量须根。通过温室练苗，约有97％的植株在沙土培养基上成活。2．禾本科牧草遗传转化体系的建立建立了川草二号老芒麦和短芒披碱草抗性愈伤组织的筛选方案。较好的筛选剂是潮霉素，40mg／L潮霉素浓度可较好的用于川草二号老芒麦抗性愈伤组织的筛选，60mg／L潮霉素浓度可较好的用于短芒披碱草抗性愈伤组织的筛选，筛选时间40～60天为宜。。通过对农杆菌浸染的诸多因素，如愈伤组织生理状态、农杆菌液浓度、愈伤组织类型、培养基组分、共培

7、养时间等参数的优化筛选，建立了农杆菌介导的川草二号老芒麦和短芒披碱草转基因操作体系。具体方案如下：构建牧草表达载体pCAMBIAl304．ppip，其T-DNA上携有潮霉素抗性基因(hptII)和类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因(ppip)，然后经根癌农杆菌EHAl05介导转化结构致密、颗粒状、黄白色的胚性愈伤组织。最后通过潮霉素筛选和对抗性植株进行分子检测，获得了转基因植株。通过验证，该体系可以获得较高的抗性愈伤率，平均可达到22％左右；以及较高的转化率，平均为10％左右。过农杆菌介导将杀虫蛋白基因转入优质牧草一川I草二号

8、老芒麦和短芒披碱草，获得转基因植株，在国内外属首次报告。关键词：禾本科牧草；组织培养；农杆菌介导法；类产碱假单胞菌杀虫蛋白基因；遗传转化四川大学博士学位论文EstablishmentofAgrobacterium-MediatedGeneticTransformationSystemsinForagePlantswithInsec