《IH基本技术》PPT课件

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1、《免疫组化基本技术》第一部分组织与细胞材料的制备内容：组织与细胞材料的取材和保存主要内容一、人体组织标本的取材二、动物组织标本的取材三、取材注意事项四、细胞标本的准备五、组织的固定、脱水、透明和包埋六、切片七、组织与细胞材料的保存概述免疫组织化学（Immunohistochemistry;IHC）技术是一门综合性技术，除了具备优质、高效，特异的一抗，敏感的检测方法，稳定的显示系统外，还需要掌握组织标本或标本的取材、固定、包埋、切片，以及IHC前的处理，内源性酶的消除方法，非特异背景的消除方法，怎样防止IHC染色过程中的脱片。一、人

2、体组织标本的取材手术切除标本，各种活检穿刺标本和尸体解剖标本。1.手术切除标本的取材：抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。2.各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。3.穿刺标本的取材：光镜（HE、特殊染色、IHC、ISH）电镜（透射电镜、免疫电镜）4.尸检组织的取材病人死亡后，一般要在数小时后才能做尸检，因此，及时取材，尽早固定是开展IHC检测的关键。二、动

3、物组织标本的取材动物的处死方式一般为活杀，组织标本来源较新鲜，10min内即可完成固定和冷冻保存，脑组织和神经组织应采用灌注固定后，再进行后固定。动物处死方法：1.麻醉法乙醚或4％戊巴比妥静注2.空气栓塞法3.断头法4.击头法5.股动脉放血法三、组织取材注意事项1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。动物组织取材要求心脏还在跳动时取材。2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小厚为0.1～0.3cm，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定5.取材时间原则上，

4、应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。6.注意包埋方向7.边缘标记8.保持材料的清洁9.切除不需要的部分10.明确编号，登记11.骨组织还需脱钙四、细胞材料的准备细胞的取材和制片法：1.印片法：常用于活检或手术切除标本。将新鲜标本沿病灶中心剖开，将病灶区轻压于载玻片上，吹干后立即固定20～30min。优点：操作简单，抗原保存好缺点：细胞厚薄不均，IHC染色易引起背景染色。2.穿刺吸取法3.沉淀法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多而细胞较少的标本。（1）常规细胞玻片制片法（2）单核细胞分离法3.

5、制备细胞玻片应注意（1）易脱片；（2）细胞应集中在直径0.6～1.0cm的圆圈内，总数105-106；（3）富于粘液的标本，未经处理不宜做IHC。4.活细胞标本的制备法培养的活细胞可分贴壁和悬浮二种。贴壁细胞可将（1）细胞大量培养后，经消化将细胞制成悬液（106）涂在涂有切片粘合剂的载玻片上，凉干后固定。（2）将细胞直接培养在盖玻片上。（3）将细胞直接培养在6孔或9孔板上，经固定后可行IHC。五、组织标本的固定1.目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各

6、种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。2.固定液的种类(1)甲醛固定液10％福尔马林10％中性福尔马林10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液重铬酸

7、钾25mg氯化汞10g冰醋酸50ml蒸馏水800ml(5)ZamboniS液多聚甲醛20g饱和苦味酸150mlPB液至1000ml(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸钾25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液甲醇60ml，氯仿30ml，醋酸10ml，混均后4℃保存备用，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊

8、二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂丙酮、乙醇类固定剂其固定原理主要是对蛋白质的沉淀而发生固定作用。3.固定方法的选择及注意事项(1)大小2cm×2c