志贺菌多重耐药的分子机制研究

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1、郑州大学博士学位论文志贺菌多重耐药的分子机制研究姓名：宋春花申请学位级别：博士专业：流行病与卫生统计学指导教师：段广才20070530郑州人学2007届博十学位论文志贺菌多重耐药的分子机制研究尚缺乏志贺菌从敏感株转变为多重耐药株的系统的、全面的研究和评价资料，而本课题的设计立足于整体，从全基因组、蛋白质组的角度研究志贺菌的耐药机制。本课题以对多种抗生素敏感的志贺菌株为研究对象，采用抗生素次抑菌浓度自身诱导及接合基因转移两种方式，分别构建多重耐药菌株，通过抑制性消减杂交技术阐明志贺菌多重耐药的核酸基础：通过对志贺菌多重耐药蛋白质组学研究，从蛋白质水平上阐明志贺菌多重耐药相关蛋白

2、的种类及其作用：并综合评价志贺菌在多重耐药产生过程中获得耐药性的主要方式及其共存的耐药机制，为志贺菌的分子流行病学监测、研发新型抗菌药物及指导临床j下确使用抗生素提供科学依据。实验方法1．最低抑菌浓度的测定以头孢噻吩(cefalotin，CF)、诺氟沙星(norfloxacin，NOR)、庆大霉素(gentamycin，GM)、磺胺甲基异恶唑(cotrimoxazole，SMZ)四种抗生素为指示药物，采用改良Kirby—Bauer法筛选临床分离的福氏志贺菌敏感株和大肠埃希菌多重耐药株，用琼脂稀释法测定抗菌药物对志贺菌敏感株的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryco

3、ncentration，MIC)。2．次抑菌浓度诱导实验志贺菌敏感株在112MIC的抗生素LB培养基中连续12代培养，若诱导后MIC二一>4倍诱导前即为诱导多重耐药菌株(以下简称诱导株)。3．接合转移实验以筛选出的志贺菌敏感株为受体菌，以多重耐药大肠埃希菌为供体菌，在约4倍MIC抗生素浓度作用下进行接合转移构建志贺菌基因转移多重耐药株(以下简称转移株)。4．志贺菌多重耐药抑制性消减杂交文库的构建采用抑制性消减杂交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)实验(1)采用细菌基因组提取试剂盒提取志贺菌敏感株、诱导株及转移株的全基因组DNA，

4、以志贺菌敏感株基因组DNA为参照(Driver)，诱导株、转移株基因组DNA为样本(Tester)，Tester和Driver的DNA分别用同～种识别四碱基序郑州人学2007届博十学位论文志贺苗多重耐药的分子机制研究列的限制性内切酶Rsa1四碱基酶切获得平均长度约600bpDNA片段。(2)将TesterDNA均分为两份，分别接上接头Adaptor1和Adaptor2R。接头外侧序列与第1次PCR引物序列相同，而内侧序列则与第2次巢式PCR引物序列相同，有利于后续PCR的筛选扩增。此外接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点，为以后克隆和测序提供方便。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定连

5、接效率在25％以上，说明DNA片段与接头连接效率较高。(3)两轮消减杂交：用过量DriverDNA样品分别与上述两份连有接头的TesterDNA样品进行第1次消减杂交。然后，混合上述两份杂交样品，同时加入新的变性DriverDNA进行第2次消减杂交，这一次杂交进一步富集了差异DNA。(4)两次PCR反应：加入根据接头设计的引物进行两次PCR；第一次PCR基于抑制反应，只有两端连接有2个不同接头的双链DNA片段才能得到指数扩增。第二次PCR实际上是巢式PCR，极大地提高了扩增特异性，使目的基因片段得到大量富集。(5)消减效率的检测：以经消减杂交和未经消减杂交第2轮PCR产物为模

6、板，23SrRNA5’和3’primers为引物进行PCR扩增，评价消减效率。2％琼脂糖凝胶电泳鉴定两次PCR产物及消减效率。(6)将诱导及基因转移多重耐药抑制性消减杂交产物与pMDl8-T载体连接并转化DH5a高效感受态细胞，克隆增殖，蓝白斑筛选阳性克隆，并对全部阳性克隆30％甘油保存，构建抑制性消减杂交文库。5．志贺菌多重耐药相关基因的筛选采用PCR技术分别对两个消减杂交文库中部分阳性克隆鉴定后利用斑点杂交对鉴定的阳性克隆PCR产物进行筛选。对筛选到的多重耐药相关基因用M13双向引物测序，并将测序结果在BLAST上进行同源性比对。6．志贺菌多重耐药的蛋白质组学分析(1)应

7、用双向电泳(two—dimensionalelectrophoresis，2-DE)技术比较志贺菌多重耐药株与敏感株的全菌蛋白表达谱。采用超声兼Urea．CHAPS．DTT裂解提取法制备志贺菌敏感株、诱导株、转移株全菌蛋白，Bradford法蛋白定量。(2)将提取的三种菌株的100pg全菌蛋白在IPGphor水平电泳仪上进行第一郑州大学2007届博十学位论文：占贺苗多重耐鲥的分子机制研究相等电聚焦，然后在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中分别平衡15mira转移到第-kllSDS．PAGE凝胶，在恒功率(1