银杏组织、细胞悬浮培养及银杏黄酮和萜内酯的提取、纯化和检测方法研究

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1、大连理工大学博士学位论文银杏组织、细胞悬浮培养及银杏黄酮和萜内酯的提取、纯化和检测方法研究姓名：李春斌申请学位级别：博士专业：生物化学工程指导教师：王关林20020301大连理工大学博士学位论文在培养的第15天加入O．1．-0．29／L的苯丙氨酸，在培养的第20天收获，最有利于银杏细胞悬浮培养系中黄酮和萜内酯的生产。细胞悬浮培养物中黄酮含量可达3．35％，萜内酯含量可达0．0758％。本实验还对银杏叶及银杏组织细胞培养物中有效成分的提取、纯化和检测方法进行了研究，发现将银杏叶粉碎成40～60目，在料液比为1：15的情况下以70％乙醇

2、为提取溶剂，先微波预处理20S，然后用超声波强化萃取5min，重复操作2次，银杏叶中有效成分提取率可达98．5％。GBE粗提液经液一液法去杂后，将提取液中黄酮浓度稀释为1．帖1．2mg／ml左右，再以10倍柱体积的提取液控制吸附流速为4倍树脂柱体积m用HPDl00大孔吸附树脂吸附，吸附完全后依次用去离子水、20％乙醇洗涤，再用流速为2倍树腊柱体积m的90％乙醇解吸的方法获得的GBE精提物经分光光度法和I-IPLC法检测黄酮苷为26．1％，萜内酯为6．2％，达到国际标准。对银杏黄酮提取液采用微波强化水解、HPLC检测；对银杏内酯采用1

3、0％甲醇回流提取、单柱层析纯化、RP．HPLC分析,n--极管阵列检测器检测，以上方法减少了样品的预纯化时问，且操作简便，易于掌握，可在短时间内检测很多样品。这将为以银杏时提取物为主要原料的厂家对其产品中有效成分含量的测定提供极大的方便。关键词：银杏有效成分组织培养细胞悬浮培养提取检测7李春斌：银杏组织、细胞悬浮培养及银杏黄酮和萜内酯的提取、纯化和检测方法研究AbstractGinkgobilobaLisalsocalledwhitefruitagetree,anditisoneofthehigherplants，whichhave

4、thelongestlife．TheleavesfromGinkgobilobaL．mainlyincludedsomee目fec帆constituents．suchasflavonoidsandginkgolides，whichcanaggrandizethebloodvessel，increasetheoutflowofblood，improvethekineticofblood-circulating，decreasetheresistingforceofcerebrovascular,suppressthrombisisan

5、dcleanfleeradicalofhumanbody．GirKgolideBespeciallyisthemosteffectiveagonistofplaqueactivationfactor(PAF)andnowbecomeahotresearchissueinthemedicinefieldoftheworld．Now,FlavonoidsandginkgolidesweremainlyextractedfromtheleavesofGin船obiloba．，buttheleavesoftencontainhighcont

6、entofcoriousandcereous，andtheeffectiveconstituentisverydifferentunderthevariousconditions．Inaddition，theconstituentofginkgolidesisverylowintheleaves,andthusthequalityofextractionisdifficulttoreachtheintemationaistandards．nelargeareaplantationofGinkgo6泐施occupiedtherarec

7、ropland．Inordertosolvetheproblemabove．inthisstudy,thecallusandcellsuspensioncultureclonewereconstructedusingplantcellengineeringtechnology．Afterseveralgenerationselectionanddomestication，thecellsuspensionclone，whichCanvigorousgrowandcontainedhighercontentofftavonoidesa

8、ndginkgolides，wereconstructed．Theresultsshowedthecontentsoffiavoneandginkgolidesinthecallusculturesubstanceswelt：a跽ct