SurvivinsiRNA在体外诱导Panc1细胞凋亡的实验研究

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1、Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实验研究作者：邱文洪郭凯文宋文剑沈关心【摘要】探讨RNA干扰技术抑制Survivin对人胰癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响。方法：体外设计、合成针对survivin基因的小分子干扰RNA(survivin-siRNA)，应用脂质体介导survivin-siRNA转染Panc-1细胞后，MTT试验测定转染细胞的增殖抑制率，RT-PCR检测细胞survivinmRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞凋亡诱导作用。结果：转染survivin-siRNA的Panc-1细胞增

2、殖明显受抑制，与对照进行比较，具有显著性差异（P<0.01）；经琼脂糖凝胶电泳，转染survivin-siRNA的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带，而对照细胞未见到。结论：survivin-siRNA能够显著诱导Panc-1细胞凋亡。【关键词】siRNAsurvivinPanc-1凋亡　　TheStudyofsiRNAofSurvivinGeneInducedApoptosisinPanc-1CellLineinVitroQiuWenhong，etal(DepartmentofImmunology,CollegeofMedici

3、ne,JianghanUniversity,Wuhan430056)AbstractObjective：Toexploretheeffectsofsurviving-siRNAoninducedapoptosisinhumanpancreaticcancer8celllinePanc-1.Methods:ThesmallinterferenceRNA（siRNA）targetingsurvivingenewasdesignedandsynthesizedbytranscriptioninvitro.SurvivinsiRNAwastran

4、sferredintoPanc-1celllinebylipofection.TheoppositelivabilityonPanc-1celllinewasassayedwithMTTtest.ExpressionofsurvivinwasdetectedbyRT-PCR.ApoptosiswasdetectedbyDNAgelelectrophoresis.Results:SurvivinsiRNAobviouslyinhibitedthePanc-1cellsgrowth(P<0.01).Agarosegelelectroph

5、oresisofgenomicDNAfromSurvivinsiRNAtransferredPanc-1cellsshowedtypicalDNAladder,butDNAfromothercellsdidnot.Conclusion:SurvivinsiRNAcouldeffectivelyinduceapoptosisinPanc-1cells.　　KeywordssiRNA；Survivin;Panc-1cellline；Apoptosis生存素（Survivin）是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotei

6、n,IAP)家族新成员。它作为一种新的凋亡抑制因子，其组织分布和作用机制的独特性已引起国外学者的广泛关注［1］。深入研究RNA干扰技术的作用将为人胰腺癌的基因治疗提供一种较有效的方法。　　1材料和方法8　　1.1材料Panc-1细胞本室保存；脂质体LipfectamineTM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自SantaCruz公司；TaqDNA聚合酶，逆转录试剂盒购自MBI公司；RPMI1640培养基，TRIzolRNA分离试剂盒购自GIBCO公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自BeytimeBiotech

7、nology公司。　　1.2设计survivin特异性siRNA根据survivin基因在GenBank中的序列，应用美国Ambion公司的设计软件设计相应的siRNA，同时在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性，人工合成针对740～761nt位碱基靶序列的两条寡核苷酸链模板。　　1.3合成survivin特异性siRNA稀释上、下游模板，终浓度均为100μmol/L，分别与T7启动子序列连接，70℃5min，室温5min，37℃延伸30min，体外转录，37℃2h，siRNA的正

8、、反义RNA结合，37℃过夜，去除前导序列和DNA模板，37℃2h，用层析方法纯化siRNA。测定合成的siRNA8260nm的吸光度(A)值，定量后-70℃保存。　　1.4细胞转染采用常规方