犬瘟热病毒ELISA和RTPCR检测方法的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文犬瘟热病毒ELISA和RT-PCR检测方法的研究姓名：许莎琼申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：朱建国20060101上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究工作所取得的成果除文中已经注明引用的内容外本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担学位论文作者签名许莎琼日期2006年1月10日3犬瘟热病毒ELISA和RT-PCR检测方法的研究摘要犬瘟热CanineDis

2、temper是由犬瘟热病毒CanineDistemperVirus,CDV引起犬和肉食目中许多动物的一种高度接触性传染病该病的传染性强发病率高本病诊断比较困难传统的检测方法在灵敏性和特异性上存在一定局限性另外,在犬瘟热弱毒疫苗广泛应用的背景下大多数犬的血清对犬瘟热病毒呈阳性反应犬瘟热是对实验用犬危害最大的病毒病之一建立现代实验动物微生物学质量监测体系基本原则是对该病必须同时包括检测病原体和检测抗体两个方面本实验包括建立了检测犬瘟热病原体的RT-PCR方法和检测抗体的ELISA方法两种检测方法互相补充综合判定结果研究工作可分为2个部分第一部分犬瘟热病毒间接E

3、LISA法检测技术的建立与初步应用采用RT-PCR法扩增出犬瘟热病毒标准疫苗株的融合蛋白基因F基因片段约1499bp核衣壳蛋白基因N基因片段约825bp克隆到pMD18-T载体酶切鉴定后用一对特异性的引物扩增约732bp的F蛋白基因片段830bp的N蛋白基因片段这两个基因定向克隆到原核表达载体pET-28a+中后重组质粒转化到宿主菌BL21中在371.0mMIPTG诱导下F蛋白基因N蛋白基因片段获得了良好表达表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定结果显示其表达的融合蛋白大小分别为28KDa33KDa与预期值相符诱导条件的改变IPTG的浓度改变对表达量影响不大We

4、stern印迹显示表达产物能被CDV抗体特异性识别实验结果表明这两种重组蛋白保留了天然蛋白的部4分抗原性为进一步研究犬瘟热病毒及其检测方法奠定基础利用pET-28a的HisTag使目的蛋白得到较好的纯化简易的棋盘滴定法确定抗原包被浓度F蛋白为10g/mlN蛋白5g/ml以此建立间接ELISA法用ELISA法检测20份样品血清两种蛋白的检测结果符合率为100%另外对血清做一系列浓度稀释从中得出以F蛋白为抗原样品血清的平均稀释度为11025以N蛋白为抗原样品血清的平均稀释度为12630第二部分犬瘟热病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用本研究通过特异性扩增C

5、DV核蛋白基因保守序列建立了检测CDV核酸的RT-PCR法用NDVCPVPRVIBV进行特异性试验结果显示该方法有较好的特异性RT-PCR检测的20份血样中阳性阴性结果与临床试纸法检测结果相同而9份试纸检测为可疑的样品中有4份为阳性结果表明该方法的灵敏性与特异性较高本研究成功地建立了检测样品血清中CDV抗体的ELISA方法与检测样品中CDV抗原的RT-PCR方法为探索建立实验动物微生物学质量监测体系打下基础关键词犬瘟热病毒ELISART-PCR检测方法5STUDYONDETECTIONOFCANINEDISTEMPERVIRUSBYELISAANDRT-P

6、CRABSTRATCaninedistempervirus(CDV)infectioncausesafrequentlyfatalsystemicdiseaseinabroadrangeofcarnivorespecies,withhighmorbidityandmortality.TraditionalmethodsforlaboratorydiagnosisofCaninedistemper(CD)arenotsufficientlysensitiveandspecific.Becauseofthewidespreaduseoftheattenuate

7、dvirusvaccine,mostofdog’sserumispositivetoCDV.CDisoneofthemostharmfulviraldiseasesforexperimentalanimals.Itisnecessarytodetecttheantigenandantibodyofdiseaseforestablishingthesystemofmicroorganismqualitymonitoringforexperimentalanimal.Inthisstudy,themethodofRT-PCRwasestablishedford

8、etectingtheantigenandELISAforthea