秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC7721体外作用的研究

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1、秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC-7721体外作用的研究【摘要】目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法MTT法检测秦艽总苷对人肝癌SMMC-7721细胞生长的影响，流式细胞仪分析细胞凋亡率，瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为125，250，500，1000μg/ml时，SMMC-7721细胞的生长受到不同程度的抑制，且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导SMMC-7721细胞凋亡；倒置显微镜下SMMC-7721细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝

2、癌细胞SMMC-7721有抑制增殖和诱导凋亡的作用。【关键词】秦艽总苷；SMMC-7721细胞；凋亡中药秦艽味苦、辛，性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用［1～9］。本研究以人肝癌细胞SMMC-7721为研究对象，观察秦艽总苷对SMMC-7721细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响，并以龙胆苦苷（>99%）作对照，比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。　　1材料与仪器9　　1.1样品　　秦艽总苷(艽龙胶囊)购

3、自西安正大制药有限公司，龙胆苦苷标准品（>99%）购自上海华美工程公司。秦艽总苷用PBS溶解，20μl过滤除菌，获1g/ml储备液备用；龙胆苦苷用PBS溶解，20μl过滤除菌，获104μmol/L备用。　　1.2细胞系　　SMMC-7721细胞由南京中医药大学药理实验室提供。　　1.3试剂　　胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，DMEM培养液购自Gibco公司，AnnexinV-FITC凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司，瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。　　1.4仪器　　细胞培养箱（HT151）

4、购自上海力申科技有限公司，酶联免疫检测仪（SUNRISE）购自瑞士TECAN公司，BDFACSCalibur流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司。9　　2方法　　2.1SMMC-7721细胞培养　　SMMC-7721细胞用含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达80%～90%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞，实验时取指数生长期细胞。　　2.2细胞生长情况测定　　细胞用0.25%胰

5、蛋白酶消化后，用DMEM培养液调细胞浓度为104个/L，每孔90μl接种于96孔培养板内，分别加入10μl31.25，62.5，125，250，500，1000μg/ml的秦艽总苷，设6个复孔。并设立加104μmol/L的龙胆苦苷对照组，加PBS的阴性对照组。培养24，48，72h后加入5mg/ml的MTT20μl继续培养4h，吸弃孔内培养液后每孔加入DMSO100μl,使结晶充分溶解，酶标仪测其吸光度，波长550nm。细胞生长抑制率（%）=（1-药物组吸光度/阴性对照组吸光度）×100%。　　2.3流式细胞仪测

6、定9　　SMMC-7721细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/L，每孔2700μl接种于6孔培养板内，分别加入300μl的1，5，10mg/ml的秦艽总苷，设立3个复孔，并设立加104μmol/L的龙胆苦苷为阳性对照组，加PBS为阴性对照组。继续培养48h后，吸弃孔内培养液，收集细胞，离心，用PBS洗2次，加入500μl的BindingBuffer悬浮细胞，加入5μlAnnexinV-FITC混匀后，加入5μlPropidiumIodide,混匀,室温、避光、反应15min后在上机检测细胞凋亡。　　2.4

7、瑞-姬氏染色观察　　细胞形态将盖玻片置于六孔板内，分别2700μl106个/L的细胞悬液，加入1000μg/ml的秦艽总苷300μl,并设立阴性对照组，继续培养48h，吸弃孔内培养液，取出盖玻片平置于染色架上，滴加复合染液3～4滴，使其迅速盖满盖玻片，染色1min后滴加缓冲液6～10滴，轻摇玻片，使其充分混合，5～7min后自来水冲去染液，待干后于光学显微镜检查。　　2.5统计学处理　　采用SPSS15.0进行数据处理。　　3结果9　　3.1秦艽总苷对SMMC-7721细胞增殖的影响　　结果见表1。由表1可见，秦

8、艽总苷浓度为31.25，62.5μg/ml时无抑制作用，而在125，250，500，1000μg/ml时有一定的抑制作用，其抑制率随浓度和时间而呈上升趋势（P<0.05），与同浓度的龙胆苦苷相比秦艽总苷抑制率较大。表1秦艽总苷对SMMC-7721细胞增殖的影响（略）　　3.2不同浓度秦艽总苷对细胞凋亡的影响　　结果见表2及图1～2。随着秦艽总苷浓度的增加，早期凋亡期