近皮层大鼠C6胶质瘤模型的建立研究

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1、近皮层大鼠C6胶质瘤模型的建立研究【摘要】目的：建立一种便于开骨窗及肿瘤切除的近皮层大鼠C6胶质瘤模型。方法：立体定向下将C6细胞接种于大鼠脑皮层、白质交界处，建立近皮层荷瘤鼠模型。取7只模型鼠，分别于接种的第7、11、15天行头颅MRI检查，了解肿瘤的生长情况。行病理HE切片观察、流式细胞DNA细胞周期分析及GFAP免疫组织化学检测，了解肿瘤的生长特性和病理特征。5只荷瘤鼠及2只正常大鼠经尾静脉注入5ALA后，取肿瘤组织及脑组织制成细胞悬液行荧光分光光度分析，探讨血脑屏障的破坏情况。取29只荷瘤大鼠，分成开骨窗组、开骨

2、窗加取瘤组及对照组，观察生存期。结果：用本法建立近皮层C6胶质瘤模型54只，52只成功建立模型，成功率96.3%。病理、流式细胞、免疫组织化学显示大鼠C6胶质瘤生长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似；对照组、开骨窗组及开骨窗加肿瘤切除组生存期分别为（32.0000±8.9815）、（41.8889±6.4618）、（59.4000±14.4160）d。行组间单向方差分析，生存期比较有统计学差异（P<0.05）。结论：该方法建立的胶质瘤模型稳定，生长特性和病理特征与人脑胶质瘤相似，便于开骨窗及切除肿瘤，是进行胶质瘤研究的较

3、好模型。【关键词】近皮层C6胶质瘤骨窗大鼠11胶质瘤大鼠模型仍是目前研究胶质瘤的较好模型。许多学者将C6胶质瘤细胞接种于大鼠的尾状核区，建立颅内荷瘤鼠模型。目前这一方法已相当成熟［13］，缺点是接种的肿瘤位置深在，行手术切除或行热疗、光动力治疗研究时肿瘤显露比较困难。体外细胞实验及皮下荷瘤鼠模型虽然建模简单，但无法准确模拟颅内特殊的病理生理状况特别是血脑屏障的影响。本实验的目的是建立一种便于开骨窗及肿瘤切除的大鼠胶质瘤模型，为研究胶质瘤提供一种选择。1材料和方法1.1材料C6细胞株：购自中国科学院上海细胞研究所。SD大鼠

4、54只，雄性，质量260310g，购自东南大学医学院实验动物中心。5ALA购自Sigma公司。RMPI1640为GIBCOL公司产品，胎牛血清购自杭州四季青公司。1.5TeslaMR(东南大学附属中大医院提供使用)，江湾Ⅰ型C动物立体定向仪及F2500荧光分光光度计（南京航空航天大学提供使用），BD公司产FACScalibur流式细胞仪（南京大学开放实验室）。1.2方法1.2.1细胞培养及动物模型建立C6细胞常规培养于含10％胎牛血清、青霉素G（100IU·ml-1）、链霉素（50μg·ml-1）的RMPI11164

5、0培养基中。培养条件：100ml培养瓶置于37℃、5％CO2培养箱中，每12天换液1次。将处于对数生长期的细胞消化、离心后，用不含血清的RMPI1640培养基吹打后计数，再次离心洗涤去血清及胰酶后加入不含血清的RMPI1640（含琼脂糖15mg·ml-1）制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×104μl-1。大鼠采用4％戊巴比妥钠（1ml·kg-1）经腹腔麻醉，立体定向仪固定，常规消毒、铺巾、切开，暴露前囟，用牙科钻于中线右3.5mm、冠状缝后1mm处钻孔。用25μl微量注射器将上述细胞悬液10μl，距离颅骨表面进针3.5mm,

6、退针0.5mm,待细胞沉淀充分后注射。注射速度为1μl·min-1,注射完毕后留针5min。骨孔用骨蜡封闭。1.2.2肿瘤鉴定所建立荷瘤鼠7只，于接种后第7、11、15天行俯卧横断位、冠状位、矢状位T1WI、T2WI及增强扫描。扫描参数：T1WI采用SE序列；T2WI采用FSE系列；增强造影剂为钆双胺注射液（AmershamHealth公司），剂量为1.2ml·kg-1,经尾静脉注射。病理切片：标本经10％甲醛固定，石蜡切片，HE染色。免疫组织化学检查：大鼠经颈总动脉相继以生理盐水及4％多聚甲醛PBS溶液（pH7.35）

7、灌注固定后取脑，制成石蜡切片，脱蜡水化后与GFAP作免疫组织化学检查，用ABC法染色。流式细胞学检查：取第11天荷瘤鼠，处死后取米粒大小的瘤组织，经剪碎、胰酶消化、过滤、漂洗后用70％乙醇固定，行流式细胞DNA细胞周期分析。111.2.3肿瘤对血脑屏障的影响5只荷瘤鼠及2只正常鼠经尾静脉注入5ALA。4h后，荷瘤鼠分别取瘤组织、肿瘤周边脑组织及对应的左侧脑叶组织，正常大鼠取右侧相应部位脑组织。组织块约3mm大小，经洗净血液后，剪碎、消化、过滤打匀制成细胞悬液，行荧光分光光度计分析。激发波长为402nm。1.2.4颅骨开骨

8、窗，肿瘤切除对荷瘤鼠的影响取29只近皮层胶质瘤模型，其中开骨窗加肿瘤切除组13只，于接种第11天以接种针道为中心开5mm×5mm大小骨窗，暴露瘤组织并在头带式显微镜下切除；开骨窗组大鼠9只，于接种第11天同上法开骨窗，但不切除肿瘤；其余7只荷瘤鼠不予开骨窗，设为对照组。3只开骨窗加取瘤组术后行头颅MRI