人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达

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1、人白介素24cDNA克隆、突变纠正和原核表达作者：魏丽丽，李成华，袁成福，陈济，丁嵩涛，刘革力，易发平，宋方洲【摘要】目的获取人白介素24(IL24)cDNA，构建原核表达载体以表达含有谷胱甘肽S转移酶(GST)的融合蛋白GSTIL24。方法以人外周血单核细胞(PBMC)总RNA为模板，RTPCR扩增IL24cDNA，克隆入原核表达载体pGEX4T2，测序结果显示在IL24cDNA第223位G→A，370位T→C，从而导致其编码蛋白的氨基酸发生改变：A75T，H124Y，通过二次PCR将其纠正，重组载体pGEXIL24转化大肠杆菌BL2

2、1(DE3)，异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDSPAGE，Westernblot检测显示有融合蛋白GSTIL24表达。结果通过RTPCR及二次PCR得到人IL24cDNA，构建其原核表达载体，经IPTG诱导在相对分子量约为50000处有融合蛋白表达。结论IL24的重组载体在大肠杆菌BL21(DE3)可以表达GSTIL24融合蛋白。【关键词】白介素24；二次PCR；突变纠正；融合蛋白；克隆；原核表达白细胞介素24(interleukin24,IL1024)是1995年由美国哥伦比亚大学的Jiang等[1]研究发现的，

3、它能选择性地抑制广谱癌细胞生长，促进凋亡，并具有一定的免疫调节能力。经复制缺陷腺病毒携带的IL24已经进入II期临床试验，研究结果显示：疗效显著而毒副作用很少[2]。因此，IL24有望成为肿瘤基因治疗的一种新的候选基因。我们拟通过RTPCR方法获取IL24cDNA，构建其原核表达载体，并诱导其表达，为进一步的研究奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料　　大肠杆菌E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)为本室保存。pGEX4T2(4970bp)购自Amersham公司。淋巴细胞分离液购自鼎国公司。Trizol，BamHⅠ，XhoⅠ，

4、pyrobestTMDNApolymerase，DNA连接试剂盒,引物的合成和重组质粒测序由TaKaRa公司完成。RT试剂盒购自TOYOBO公司。DNAmarker、小量质粒纯化抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。小分子量蛋白marker购自博大泰克公司。抗谷胱甘肽S转移酶(glutathioneStransferase,GST)抗体及其二抗购自Merck公司。　　1.2IL24的基因克隆10　　通过淋巴细胞分离液分离健康人静脉血的外周血单核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)，用Trizo

5、l提取其总RNA,通过RTPCR扩增IL24cDNA，RT反应体系：2μLRNA，1μLoligdT(20)，9μLRNasefreeddH2O70℃5min，冰浴10min，再加入4μL5×RTbuffer，2μLdNTPs，1μLRNaseinhibitor，1μL莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukaemiavirus,MMuLV)反转录酶30℃10min，42℃20min，99℃10min。根据GenBank中人IL24基因序列(登录号：NM006850)通过DNAStar软件设计IL24引物，并在引物的5′端引入酶切

6、位点，上游引物a：5′CGGGATCCATGAATTTTCAACAGAGGCTG3′，下游引物b：5′CCGCTCGAGCTAGACATTCAGAGCTTGTAG3′(划线部分分别为BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点)，管家基因G3PDH(glyceraldehyde3phosphatedehydrogenase)引物序列：PrimerR：5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′；PrimerF：5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′，扩出的片段长450bp。PCR反应体系：ddH2O8.4μL，10×PCRbuffer2μ

7、L,dNTPs(2.5mmol/L)1.6μL，引物a、b各2μL，PrimerR、F各0.4μL，cDNA3μL，DNA聚合酶0.2μL，94℃5min，94℃30s，56℃30s，72℃1min(30)，72℃10min。　　1.3原核表达载体的构建　　将PCR产物和pGEX4T2载体分别用BamHⅠ/XhoⅠ10双酶切，胶回收试剂盒纯化，TaKaRa连接试剂盒连接16℃30min，转化E.coliDH5α感受态，酶切鉴定，将阳性克隆送TaKaRa公司测序。　　1.4IL24cDNA点突变的纠正　　223位G突变为A，设计其纠正引物c、d；370

8、位T突变为C，设计其纠正引物e、f,c：5′TCTTTCACAGC