人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化

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1、人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化作者：余厚友　宋祖军　袁顺书　刘彦仿　杨守京【关键词】肝肿瘤关键词:肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达摘要:目的克隆人热休克蛋白72（HSP72）基因，原核表达并纯化蛋白产物，以探讨其生物学功能.方法从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中，用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中，在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和SephacrylS200凝胶过滤纯化，经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上，用anti-HSP72单抗作探针，进行Weste

2、rnblot鉴定.结果克隆的基因序列分析结果与有关报道一致，所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr为72000的蛋白，经鉴定确系HSP72蛋白.结论克隆了人HSP72基因，并对该基因进行了原核表达与纯化，为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础.　　Keywords:liverneoplasms;cellline;heatshockprotein72;cloning;geneexpression　　Abstract:AIMToclonehumanheatshockprotein72（HSP72）gene，doprokaryotice

3、xpressionandpurifyHSP72protein9forfurtherstudy.METHODSHumanHSP72genewasobtainedbyRT-PCRfromheatshockedhumanhepato-carcinomacelllineSMMC-7721.ItsproductwasrecombinedinvitrowithprokaryoticexpressionvectorpQE-30andwas　transformedtoE.colistrainJM109.Theproteins，expressedinE.colistrainwith

4、HSP72recombinantplasmidunderIPTGinduction，wasobtainedbyFPLCandSephacrylS200chro-matographyandcharacterizedbySDS-PAGEandWestern-blot-confirmedwithanti-HSP72McAb.RESULTSTheHSP72genewasclonedandidentifiedtobeconsistentwithrelevantreports.TheHSP72withamolecularweightof72000washighlyexpres

5、sedinpQE-30HSP72.WesternblotprovedthattheexpressedproducthadtheantigenicityofHSP72.CONCLUSIONTheestablishmentofaseriesofmethodsforthecloning，expressionandpurificationofHSP72genewillassistinthestructuralandfunctionalchar-acterizationofHSP72.　　0引言9　　热休克蛋白（HSP）是生物体（或离体的培养细胞）在不良环境因素作用下（如缺

6、血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等）所产生的一组特殊蛋白质，对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛，在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用，属分子伴侣蛋白［1］.热休克蛋白72（HSP72）是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关，有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因，并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达，建立了一套完备的纯化方法，为进一步研究提供了条件.　　1材料和方法　　1.1材料人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌

7、JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoRI，PstI，T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自NSBCSangon公司.DNAMarker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.　　1.2方法　　1.2.1PCR引物的设计根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列，设计了一对PCR扩增引物，并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的

8、新的酶切位