大肠埃希菌多重耐药外排泵AcrABTolc主动外排机制的研究

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1、分类号：R378．2密级：学位类别：科学学位团专业学位口0学校代码：1062学号：2010602418学科门类：医学夭肄眚科矢等硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目：大肠埃希菌多重耐药外排泵AcrAB—Tolc主动外排机制的研究TITLEResearchofactiveemnxmechanismofAcrAB--ToiCmulti·-drugeffluxPumpofEscherichiacoil一级学科：临床医学二级学科：内科学传染病论文作者：朱莉丽指导教师：刘德梦天津医科大学研究生院二。一三年四月学位论文原创性声明本人郑

2、重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：期慰咖学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在

3、——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口，(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：期：劢B年，月p日期：矽廖年妇细天津医科大学硕士学位论文中文摘要研究目的：．大肠埃希菌是当今社区感染及院内感染最常见的病原菌之一，是威胁人类健康的重要致病菌。随着抗生素在临床上的广泛应用及抗生素的升级换代，细菌对抗生素的耐药越来越严重。临床上多重耐药大肠埃希菌的出现和播散，严重影响了治疗效果，增加了治疗成本。对多重耐药大肠埃希菌的治疗是临床上非常重要的目标。细菌的耐药机制包括产生灭活酶、改变药物作用靶位、改变外膜通透性、主动外排作用，产生生物膜

4、等。其中后三种机制是细菌产生多重耐药的最主要机制。阻止药物在菌体内聚集是细菌产生抗生素多重耐药的重要手段之一，由细菌的主动外排系统介导。大肠埃希菌的细胞外膜上存在多种外排系统可泵出多种结构无关的化合物，AcrAB．TolC外排泵是其中最主要的占绝对优势的多重药物外排泵，底物广泛，研究天津地区大肠埃希菌外排泵AcrAB．ToIC在临床株中的携带情况、与耐药的相关性，及羰基氰氯苯腙(CCCP)对大肠埃希菌外排泵AcrAB．TolC的抑制作用，为临床多重耐药大肠埃希菌感染的防治探索可能的、新的思路。研究方法：1、菌株的收集、鉴定：收集2008年7月至2

5、009年7月期间天津医科大学第二医院临床分离的大肠埃希菌90株，剔除同一病例相同部位重复菌株，所有菌株采用常规生化鉴定。大肠埃希菌标准菌株ATCC25922作为质量控制菌株，金黄色葡萄球菌ATCC25923为acra／acrb基因阴性对照菌株，这两种标准菌株均为天津市感染性疾病研究所保存菌株。2、耐药模式分组：采用K—B纸片扩散法测定90株大肠埃希菌临床株对6种抗菌药物(氨曲南、头孢噻肟、左氧氟沙星、环丙沙星、庆大霉素、阿米卡星)的敏感性，药敏结果依据美国I临床实验室标准化研究所(CLSl2011)判定标准，根据耐药模式分为多重耐药组、双药耐药组

6、、单药耐药组、全敏感组。3、外排泵基因acra／acrb基因的扩增：应用聚合酶链式反应(PCR)扩增90株临床分离的大肠埃希菌acra／acrb基因片段，PCR产物送北京华大科技有限公司进行正负双向DNA序列分析。4、CCCP抑制实验：选取lO株多重耐药大肠埃希菌进行CCCP抑制实验，采取微量肉汤稀释法测定加泵抑制剂CCCP(终浓度为100umol／L)前后多重耐药菌株对5种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)。天津医科大学硕士学位论文结果：l、共收集大肠埃希菌90株，其中尿道分离菌37株，肠道分离菌36株，呼吸到分离菌5株，其它分泌物(血液、腹水等

7、)分离菌株11株。2、体外药物敏感实验结果：90株大肠埃希菌对6种抗菌药物均表现出不同程度的耐药，耐药率由高到低为环丙沙星67％，左氧氟沙星61％，庆大霉素53％，头孢噻肟50％，氨曲南20％，阿米卡星10％。耐药模式以双药耐药30株(33．3％)，多重耐药26株(28．9％)为主，单药耐药22株(24．4％)，全敏感12株(13．3％)。3、acra／acrb基因PCR扩增及测序结果：90株临床分离的大肠埃希菌中55株(61．1％)均可见567bp(acra)及516bp(acrb)的扩增片段。金黄色葡萄球菌ATCC25923未见此扩增片段。选

8、取大肠埃希菌临床株246acra基因扩增产物及临床株b716acrb基因扩增产物进行正负双向DNA序列分析，测序结果在GeneBank数