柳树AP3同源基因的克隆与表达分析

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1、南京林业大学博士学位论文柳树AP3同源基因的克隆与表达分析姓名：关亚丽申请学位级别：博士专业：林木遗传育种指导教师：王明庥;黄敏仁20060601摘要dP3基因在植物的花发育过程中具有重要作用，作为“ABC”模型的B类基因，AP3或丹与AG的作用决定雄蕊的特征。根据已知的杨树AP3同源基因PTD的保守区序列设计引物，以垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳及簸箕柳总DNA为模板，均扩增出了大小约2．1K左右的片段。根据簸箕柳DNA测序结果设计引物，利用RT—PCR技术及5’RACE、3’PACE技术，获得了簸箕柳中AP3同源基因的全长cDNA序列。该基因cDNA

2、全长为826bp，编码241个氨基酸，预测分子量大小为28kDa。根据基因组扩增片断测序结果以及簸箕柳SSMADS基因全长cDNA序列，预测出垂柳、黄花柳、黄枝白柳、杞柳、绵毛柳中／503同源基因的全长eDNA。分析表明，本实验所克隆的柳属植物AP3同源基因，在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性，分别为95％-98．7％和95．2％一99．6％，虽然它们在序列上各有差异，但全部具有AP3基因所特有的保守区域，说明该基因在柳属植物中具有较好的保守性。通过实时定量RT—PCR分析，发现SSg：II)S基因主要在簸箕柳花器官中表达，在根、茎、叶中虽然有少量表达，

3、但表达量很低。在花器官发育的不同阶段，SSMADS基因表达量也不同，在花发育的早期阶段，其表达量较低，随着花器官的发育，其表达量有所增加，然后随着花器官的成熟表达量又降低。将水稻AP3同源基因OsMADSl6的RNAi植物表达载体转入农杆菌，用叶盘法转化烟草，得到95株潮霉素抗性芽。当芽长到1．5cmc以上时，移入附加有hygromycin50mg／L的MS培养基上，大部分植株在20天左右都能正常生根。对22株转基因抗性植株进行检测，18株为PCR阳性。转基因烟草在转化前后花器官的表型变化尚在观察之中。烟草转化的成功为进行簸箕柳的转化奠定了一定的技术基础。以簸

4、箕柳当年春季萌生的新枝条为外植体，建立了其植株再生体系。探讨了基本培养基和不同组合的激素对丛生芽诱导的影响，结果表明不同基本培养基对丛生芽的诱导无太大影响，而BA为1．0mg／L、NAA为0．01mg／L时，丛生芽诱导率达到了最大，为100％；平均诱导芽数为3个／株；芽的生长状况也较好。当丛生芽长到3cm左右时，切下，在不加激素的White或B5两种基本培养基诱导其生根，生根率可达90％以上。簸箕柳组培再生体系的建立为进一步用转基因方法验证簸箕柳AP3同源基因的功能提供了技术平台。关键词：簸箕柳；AP3同源基因；克隆；表达分析；烟草转化AbstractAP3p

5、laysimportantrolesinfloraldevelopment．AsaBclassgeneof“ABC”model，AP3orP／andAGcontrolthedevelopmentofstalnentogether．ApairofprimersweredesignedaccordingtOpublishedPopulustrichocarpagene(PTD)，andan2．1Kfragmentwasamplified(PCR)byusingthegenomicDNAofSalix．Babylonica，Salix,caprea，Salix．al

6、baf,Salix．integra,Salix．eriocladaandSal及．suchowensisrespectively．Byusing5’RACEand3’RACEtechnique．thehomologueAP3genewasobtainedintheS．suchowensis．ThecompletedcDNAsequenceWas826bpandencodedforapolypeptideof241aminoacids，28KDmolecularweight．AccordingtOthefoil—lengtheDNAofS．suchowensis

7、andthegenomicDNAsequences，thefull—lengthcDNAsequencesofhomologueAP3inS．babylonica，S．caprea,S．albafS．integraandS．eriocladawerepredicted．TheresultindicatedthatthehomologueAP3genesofSalixwerehJIghconservative．with95％-98．7％identityofnucleotidesand95．2％一99．6％ofproteins．Todeterminetheexpr

8、essionpattemofSSMAD