血管抑素蛋白质真核胞内表达质粒的构建

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1、血管抑素蛋白质真核胞内表达质粒的构建作者：张利芳张亚琼邢少姬韩丽红【摘要】目的：克隆人血管抑素K1-3基因，构建重组酵母胞内表达质粒PHIL-D2/K1-3。方法：从胎儿肝脏组织用反转录-聚合酶链式反应技术(RT-PCR)扩增人血管抑素K1-3目的基因，克隆至酵母胞内表达质粒PHIL-D2中，线性化后转化毕赤酵母GS115菌株，用Sourthern杂交筛选获得阳性重组转化子。结果：用RT-PCR方法成功扩增到750bp大小的人血管抑素K1-3基因片段，并正向插入毕赤酵母染色体基因组。结论：人血管抑素K1-3基因成功整合到毕赤酵母GS115基因组。【关键词】人血管抑素K1-3;PHIL-D2;毕

2、赤酵母GS115血管抑素是目前肿瘤研究的热点，研究发现它能特异性抑制肿瘤新生血管的形成，因而能够强烈抑制肿瘤[1]，在临床有良好的应用前景。天然血管抑素来源有限，利用基因工程技术将血管抑素基因克隆获得重组蛋白有重要意义。本文成功从胎儿肝脏组织用反转录—聚合酶链式反应技术(RT-PCR)扩增了人血管抑素基因的有效片段，并构建了重组表达载体，为下一步血管抑素在毕赤酵母胞内的表达创造了条件。6　　1材料与方法　　1.1主要试剂限制性内切酶、PMD18-T载体、T4DNA连接酶、PCR试剂盒均购于宝生物工程(大连)有限公司;逆转录酶、DNA抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒购于Promegra公司;酵母转化试

3、剂盒购于Invitrogen公司。　　1.2质粒、菌株和细胞大肠杆菌DH-5α菌株、PichiapastorisGS115菌株、PHIL-D2真核表达质粒均由长春生物制品研究所生物技术室提供。　　1.3人血管抑素引物北京三博生物技术公司合成。　　P1:5’CCGAATTCATGTGCAAGACTGGGAATGGAAAG3’　　P2:5’TTGAATTCTTAACAGGACGGTATCTTACA3’　　1.4人血管抑素K1-3基因片段的扩增以1mLTRIzol试剂提取胎儿肝脏(约30mg)的总RNA，以其为模板，利用设计引物进行PCR扩增，PCR参数为:94℃30s，55℃30s，72℃90s共

4、30个循环,结束后，72℃继续延伸10min，然后置琼脂糖(1%)凝胶电泳，并回收PCR产物。6　　1.5pMD18-T/K1-3质粒构建将扩增产物K1-3基因片段克隆入载体pMD18-T，用EcoRⅠ与HindⅢ双酶切鉴定，并测序。　　1.6PHIL-D2/K1-3质粒构建pMD18-T/K1-3与PHIL-D2同时用EcoRⅠ限制性内切酶进行酶切，产生共有的粘性末端，再用T4DNA连接酶连接，构建表达载体PHIL-D2/K1-3。用SacⅠ(PHIL-D2载体上距EcoRI酶切位点735bp处)和PstⅠ(K1-3基因片段5’端150bp处)双酶切鉴定正反连接。　　1.7重组酵母转化子的筛

5、选将K1-3/PHIL-D2重组质粒用NotⅠ线性化后转化毕赤酵母(GS115菌株)中，用Southern杂交法筛选出阳性重组酵母转化子,以原始GS115菌株和转化了空白PHIL-D2质粒的GS115菌株为空白对照。　　2结果　　2.1pMD18-T/K1-3质粒构建设计特异引物用RT-PCR方法从胎儿肝脏扩增人血管抑素K1-3目的基因，克隆入pMD18-T，用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定得到预期750bp大小的特异性条带，见图1。经DNA测序，此基因片段与发表的人血管抑素cDNA序列完全一致。pMD18-T/K1-3质粒构建成功。　　2.2PHIL-D2/K1-3质粒构建用SacⅠ和Ps

6、tⅠ6双酶切K1-3/PHIL-D2重组表达质粒，出现小于1000bp的目的带(若反接将出现大于1000bp的带)，与预期结果相符，见图2。表明K1-3基因片段正向克隆入PHIL-D2，PHIL-D2/K1-3质粒构建成功。　　2.3重组酵母转化子的筛选将PHIL-D2/K1-3质粒转化入毕赤酵母GS115，重组子将发生K1-3与酵母组DNA整合。提取转化后毕赤酵母的DNA，标记上述RT-PCR扩增的K1-3基因为探针，用Southern杂交法筛选阳性克隆。结果有部分菌株阳性斑点，说明有K1-3基因的整合，筛选出阳性重组转化子，见图3。对照未显色。　　3讨论　　研究表明，血管抑素是血浆纤溶酶原

7、的内部裂解片段。纤溶酶原有5个三环结构域，称做Kringle区。血管抑素则具有前4个Kringle区和部分的Kringle5区。研究证实，起抑制血管生成作用的结构可能主要是Kringle区，并且不同的Kringle区所起的作用也不同。Kringle1-3区抑制内皮细胞增殖作用，与血管抑素基本相同。Kringle1-3是血管抑素的有效片段[1-4]，所以本课题选择该片段克隆，为以后对表达蛋白的生物活