过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响

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1、过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响作者:朱雨邹晏江舟汪宇辉刘延友王正荣【摘要】目的:评价过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响。方法:用PMA刺激NIH3T3细胞,使节律基因稳定表达后,用脂质体介导方法将质粒pcDNA3.1/Gnb2l1转染至NIH3T3细胞,并以空载体质粒pcDNA3.1/vector为对照。利用RTPCR技术检测不同时间点Gnb2l1mPer1在NIH3T3细胞中的表达水平,研究过表达Gnb2l1基因对mPer1基因表达的影响。结果:采用RTPCR技术显示成功转染,

2、实验组比对照组的Gnb2l1表达量明显增高(p<0.05)。并且发现实验组的mPer1表达量比对照组明显增高,但是经过余弦分析发现两组相比mPer1的表达周期无明显改变。结论:成功过表达Gnb2l1基因使节律基因mPer1表达量增加,中值增高(p=0.038)。【关键词】时间生物学;节律基因;Gnb2l1基因;per1基因;转染生物体普遍存在调控生命活动约为249h的近日节律[1]。mPer1为近日节律振荡器的核心组件,mPer1转录产物的磷酸化和入核在近日节律的产生和调控中起重要作用。Period1(PER1)是近日节

3、律系统中的核心蛋白,并且与机体其他功能诸如药物依赖、肿瘤发生等[2-3]密切相关。Gnb2l1是一个看家基因,在细胞接受刺激的时候,Gnb2l1基因能够迅速作出反应,编码合成RACK1蛋白,实现基因的转录调控以及转录后水平调控,并进一步引发一系列迟发反应。前期研究表明RACK1蛋白为PER1相互作用的节律相关蛋白,上调及下调PER1基因并未影响RACK1的基因转录和蛋白表达[4]。因此推测RACK1并非PER1的下游钟控蛋白,RACK1可能通过参与/介导PER1相关的信号分子通路,进而影响PER1节律及其他功能的实现。因此本文

4、研究过表达Gnb2l1发现mPer1表达量明显增高,可以推测Gnb2l1可能是mPer1的上游钟控基因。进一步揭示生物节律信号通路的分子机制、研究RACK1与PER1的功能联系提供了基础。  1材料与方法  1.1细胞株NIH3T3细胞由华西医学中心微生物教研室馈赠。  1.2试剂DMEM培养基(Hyclone),小牛血清(Hyclone),青霉素(华北制药厂),链霉素(华北制药厂),胰蛋白酶(宝信生物公司),PMA(phorboll2myristate13acetate,Promega),Trizol(Invitroge

5、n),RTPCR一步法试剂盒(Takara),TaqDNApolymerase(Tiangen),Lipofectamine2000(Invitrogen),质粒抽提试剂盒(GIAGENE)。  1.3细胞培养及诱导细胞于含10%小牛血清、100U·9ml-1青霉素及100U·ml-1链霉素的DMEM培养基中,5%CO2孵箱内37℃静置培养。NIH3T3细胞按每孔2×105个细胞接种于十二孔板,待细胞12h贴壁后,更换新鲜培养基(每孔1.98ml),每孔加PMA20μl,终浓度为100nm·L-1。  1.4转染PMA刺激2

6、4h后,按照脂质体LipofectamineTX2000说明书,将pCDNA3.1/Gnb2l1质粒转染NIH3T3细胞(A组),以pCDNA3.1/vector质粒转染细胞为对照(B组)。转染12h后,每隔2h分别收集实验组和对照组细胞各3孔,共收集48h,24个时间点。  1.5RTPCR检测Gnb2l1,mPer1的表达Trizol法提取细胞总RNA,采用半定量RTPCR法特异性扩增Gnb2l1和mPer1mRNA,分别与内参积分光密度(OD)值相比来分析Gnb2l1和mPer1mRNA相对表达水平。引物由Invit

7、rogen公司合成,序列见表1。  1.6统计分析实验结果以(x±s)表示。采用T检验进行比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。  2结果  2.1过表达效率的鉴定9  RTPCR产物电泳结果见图1。用GelProAnalyzer软件,分析Gnb2l1及βactin,经RTPCR所得条带的(OD)值,计算Rtime=ODGnb2l1/ODβactin,如图2所示。图中可以看出实验组的Gnb2l1表达量比对照组明显增高(p<0.05)。表1引物序列    2.2RTPCR测定过表达Gnb2l1基因

8、对节律基因mPer1表达的影响  过表达Gnb2l1基因转染后可导致节律基因mPer1表达显著性增高(见图3,图4)。图中可以看出ZT8,ZT11和ZT12的作用更显著,其余的时间点普遍A组比B组高。  图3mPer1电泳图图4mPer1mRNAs表达  2.3余弦法分析mP

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