脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达

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1、脑源性神经营养因子融合蛋白真核表达质粒的构建及表达作者：石秦东，张蓬勃，田玉梅，张军峰，陈新林，刘勇【摘要】目的构建以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因的脑源性神经营养因子(BDNF)融合蛋白真核表达质粒，并对其表达和定位进行研究。方法以人血白细胞DNA为模板，利用一对删除终止密码子的引物进行PCR获得BDNF基因片段，并将其与pEGFPN1质粒载体连接，构建BDNFEGFP融合蛋白真核表达质粒。以脂质体Lipofectamine2000转染Hela细胞，提取总RNA，通过RTPCR方法检测BDNFEGFP在转录水平的表达，Westernblot及荧光显微镜进一步观察融合蛋白

2、的表达定位。结果酶切和PCR鉴定证实BDNF基因片段正确克隆入载体质粒中，转染Hela细胞后，RTPCR证实BDNFEGFP融合蛋白在转录水平有表达，荧光显微镜观察显示BDNFEGFP融合蛋白主要分布于细胞质中，Westernblot结果显示Hela细胞培养液中有BDNFEGFP融合蛋白存在。结论成功构建了BDNFEGFP融合蛋白真核细胞表达质粒，BDNFEGFP融合蛋白能够在Hela细胞中表达，主要位于细胞质中并可以分泌到细胞外。【关键词】脑源性神经营养因子；绿色荧光蛋白；融合蛋白；Hela细胞11ABSTRACT:ObjectiveToconstructtheeukaryo

3、ticexpressionvectorofbrainderivedneutrophicfactor(BDNFEGFP)fusionproteinandtoinvestigateitsexpressionandlocation.MethodsBDNFDNAwasamplifiedfromthegenomicDNAisolatedfromthehumanleucocytesbyPCRwithapairofprimerswithoutstopcodon,andthensubclonedintoplasmidpEGFPN1.Therecombinantplasmidwastransfecte

4、dintoHelacellswithlipofectamine2000.TotalRNAwasisolated,andthenexpressionofBDNFEGFPgenewasdetectedbyRTPCR.TheexpressionandcellularlocationofBDNFEGFPproteinwereexaminedbyWesternblotandfluorescencemicroscopy.ResultsByanalyzingrestrictionenzymedigestionandPCR,wefoundthatBDNFgenewascorrectlyinserte

5、dintotheplasmidvector.RTPCRresultsconfirmedtheexpressionofBDNFEGFPgene.ThefluorescencemicroscopyindicatedthattheBDNFEGFPfusionproteinwasmainlydistributedincytoplasm.WesternblotresultsshowedthatBDNFEGFPfusionproteinexistedinthemediumofHelacells.ConclusionWehavesuccessfullyconstructedtheeukaryot

6、icexpressionvectorofBDNFEGFPfusionprotein,whichcouldbeexpressedinHelacells.BDNFEGFPfusionproteinismainlylocatedincytoplasmandcouldbesecretedintotheoutside.11KEYWORDS:brainderivedneurotrophicfactor;greenfluorescenceprotein;fusionprotein;Helacells脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)是神经

7、营养因子(neurotrophinfamily)家族成员之一，与其受体trkB酪氨酸激酶广泛分布于脑组织，包括皮层、纹状体、海马、丘脑、小脑等[1]。BDNF除参与神经系统发育过程中神经元的存活、生长和分化外，越来越多的证据表明也参与了成年神经系统神经元的修复与重塑，诱导成年脑内源性神经前体细胞迁移至纹状体等部位[23]。因此，BDNF对神经损伤性疾病如脑血管病、脑外伤及神经退行性疾病如Alzheimer病的治疗具有潜