神经干细胞植入缺血大鼠模型脑内存活、分化和迁移的研究

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1、中山大学硕士学位论文神经干细胞植入缺血大鼠模型脑内存活、分化和迁移的研究姓名：李鹏申请学位级别：硕士专业：神经生物学指导教师：谢富康2003.5.20塑丝王塑丝垫全然查查堕堕型堕塑壹塑：坌些塑堑堑塑堕窒—————————————生奎!堕神经干细胞植入缺血大鼠模型脑内存活、分化和迁移的研究硕士研究生李鹏-W-师谢富康中山大学中山医学院组织胚胎学教研室摘要／脑血管病变已成为人类致死致残的最主要原因之一，其中以缺血性中风最为多、见。、传统观点认为，成年中枢神经系统(CNS)中神经元不能再生。近来的研究发现，成年动物侧脑室室管膜下区(SVZ)和海马齿状回颗粒

2、层下区(SGZ)等处均存在具有前体细胞特性的神经干细胞(NSCs)。通常情况下NSCs以休眠、不增殖状态存在。在一些因素的影响下，如学习训练，奔跑，生长因子，糖皮质醇，机械损伤，癫痫发作，脑缺血等，NSCs可以发生增殖、分化和迁移。通过特殊的培养方法，人们已将NSCs分离培养并在体外得以扩增。而这一发现不仅打破了神经元不会再生的传统观念，而且为许多以往难以治疗的神经系统疾病提供了新的治疗、思路和途径。7／神经元大量死亡而引起的CNS机能障碍是中风难以治愈的根本原因。通过细胞移植替代神经元，重建CNS受损机能是较为理想的治疗方法。NSCs作为移植材料具

3、有多种优点，如低免疫源性、自我更新能力、多向分化潜能、良好的组织融合性、迁移能力等，因而可望用于缺血性中风的治疗。为此，我们分离培养了新生大鼠侧脑室及其下区的NSCs，体外荧光标记后植入大鼠缺血模型脑内四个不同的区域(缺血侧纹状体、第一感觉运动皮层下、侧脑神经：r细胞植入缺血大鼠模型脑内存活、分化和迁移的研究中文摘要室下伏核区域以及僦侧纹状体)，观察了植入细胞在不同时问点存活、分纯和迁移。，f篇一章：取新生SD大鼠(出生后2天)侧脑室及其下区神经组织，经酶消化＼铡瘫聚照悬波，用含囊EGF、bFGF窝B27豹DMEM／F12蝰养。取舔钱、第3我和第5代

4、神缀球进行Nestin、GFAP、MAP2和GAP43抗体免疫细胞化学鉴定。有盘潼条势下，第三代NSCs、第五载NSCs、标记瑶第三代NSCs、标记后第五我NSCs贴壁分化后进行Nestin、GFAP、MAP2和GAP43抗体免疫细胞化学染色，薯逶行阳性纲施计数。结采：来源予稳髓室及其下嚣神经组织的NSCs，俸，}悬浮生长并能够增殖形成神经球。原代、第3代和第5代神经球Nestin免疫反应均为阳往。有血清条彳牟下，NSCs能多淘分彳{：为GFAP、MAP2和GAP43阳性细胞。传代过程翘Hoechst33342标记对其体外生长、增髓和分化潜能没露影响

5、。第二章：取雌性sD大鼠(250土109)，不开颅线栓法行MCA0手术。术后I天和10天对存活动物逑行神经行为学测评，并记录动物死亡情况。术鬃纂10天取各评分簿级的动物，处死后取脑切片，进行HE和TTC染色。结果：术后92．4％的动物出现不露程度的毒申缀行为学骧碍。10天内动物琵亡率麓52．89％。34．71％熬麓耪存活时间大于50天。HE和TTC染色观察，缺血范围主要累及基底节、纹状体尾麦核箱部分皮层下区城。第三章：缺血后第15天，立体定位仪下，取标{已有Hoechst33342的第3代NSCs悬滚

6、5#1。实验缀t(n=20)：缺血侧纹状体、第1感觉运动皮层下、侧脑室下伏核区域3点移植；实验缀2(n=20)：健翻绞获体区域移植；对照缀(n=16)：不做处戮。移植话第lO天、20天、35天、50天，各组动物进行神经行为学测评后取脑切片(n’=5)，相邻切片儆GFAP、MAP2和GAP43抗体免疫组化学染色。结果：移植NSCs能够在坏死空溯边缘存濡，薨-参与较小菠围坏死瘸灶的填充；侧艇室下铰核和第～感觉运动皮层下区域的部分移植细胞能够向缺斑区域发生明显的趋向性迁移，50天迁移距离达2mm；予投l脑室下茯核区域的移捷细黪囊享孛经元分诧戆魄爨为23．4

7、9％，丽第1感觉运动皮层下区域为16+40％，均高于两侧纹状体移植细胞向静经元分健的魄铡(毖铡8+47％，薅铡9070％)，不潮移植区域稳NSCs淘黢矮缁静经于缨鼹糠A缺盎大惑模型酗内存活、分纯和迁移静研究中文摘要藏翻神经元方囱分纯静跑霸存在统计学差菇(P霪夺子0。05)；予软盘铡大魅半球移植的NSCs分化后MAP2阳性数量小于GAP43阳性细胞数量，丽健侧纹状体移裱缁施的分佬情况与前者穗反。y总结三部分实验结果，得到以胃结论：1．Hoechst33342对NSCs体外生长和分讫没有影响，可以用于移丰纛细胞的示踪。2．NSCs在缺血郝位能够存活、分化

8、、并参与对坏死神经组织的修复。3．撼于侧脑警下伏核和第一感觉运动皮层下区域的NSCs受局部缺血因素的影响，能