游离脂肪酸对原代培养大鼠胰岛细胞毒性作用的实验研究

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1、第一军医大学硕士学位论文游离脂肪酸对原代培养大鼠胰岛细胞毒性作用的实验研究姓名：姜一真申请学位级别：硕士专业：内分泌与代谢性疾病指导教师：薛耀明20030601英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称DMdiabetesmellitus糖尿病WAsfreefattyacids游离脂肪酸PApalmiticacid软脂酸OAoleicacid油酸AAarachidonicacid花生四烯酸INSinsulin胰岛素PBSphosphatebuffersaline磷酸生理盐水缓冲液BSAbovinese=rBmalbumin牛血清白蛋白FCSfetalca

2、lfsel'llin胎牛血清PAl(proteinkinaseK蛋白酶KR．Nasefibonuclease核糖核酸酶EDTAethylenediaminetetmaceticacid乙二胺四乙酸Tristirsoaydroxymethyl)-aminomethane三羟甲基氨基甲烷SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠TEMtransmissionalelectronmicroscope透射电子显微镜IBWesternblotting免疫印迹PCDprogrmnmedcelldeath程序性细胞死亡IRinsulinres

3、istance胰岛素抵抗IDisletl3．celldysfunction胰岛且．细胞功能缺陷rpmrevotationperminute每分钟转数bpbasepair碱基对hhour小时millminute分钟』．PIGluGSISKRBBDTZpropidineiodideglucoseglucose-stimulatedinsulinsecretionkerbs-Ringerbicarbonatebufferdithizone碘化丙啶葡萄糖葡萄糖刺激的胰岛素分泌林格碳酸盐缓冲液双硫腙中文摘要目的通过观祭游离脂肪酸(freefattyacids

4、，FFAs)对体外培养SD乳鬣胰岛细腿分泌功能静影响及较目蠢酸(Pahniticacid，P矗)诱导的体艘培养SD乳鼠胰岛细胞凋亡作用的实验研究，探讨游离脂肪酸对体外培养SD乳鼠胰岛细胞的毒性作用及可自％机制，为阐述2型糖藤病的发生机划秘防治方法戆研究提供部壹}实验板据。方法1、以SD乳鼠胰岛细胞为对象，胶原酶分次短时间消化胰骧筑织，缨蕤接穆18h最转叛继续壤奏，羧罄兔痰法捡灏壤莠滚中簇岛索及葡萄糖刺激下的胰鞠索分泌萤；胰鼬细胞活体染色及免疫魍化染氇等方法迸孬袋麓缩魏受物学滔链鉴定：饲萋嚣微镜下动态琨察胰岛绷胞生长情况。2、不同浓度的FFAs(PA

5、、OA和AA)作用体外单层培养的SD巍鼠媵岛细臌48h，较脂酸(PA)0．25mmoYL作用胰岛绷胞0、24h、48h、72h后，放射免疫法检测备组细胞胰岛素分泌髓的变化，倒置驻微镜聪察对照组和处理组细胞形态的改变。3、采用Hoechst33342／Pl双染法，逛镜鼹测、DNA片龌化援测、Western—blot蛋白质铡滗等方法，观察软脂酸(PA)诱导的胰船细胞凋亡的形态学改变帮奎豫特点。结果1、胶原酶对胰腺组织谶行分次短时间消化，细胞接种18h后转板继续培养，DTZ染色胰岛细耱魄铡为70％，台跨兰染色细藏活力90％以上，成纤维细胞较少，培养7—1

6、l天的细胞分泌功能正常。2、不同浓度FFAs作用胰岛细胞48h，低糖(2．8nⅥnol／L)刺激下的备组胰岛索分泌爨冤显著性差异(》O．05)；衰糖(27。8mmol／L)刺激下0．25emaol／L、0．5mmol／LPA、OA组胰岛素分泌量显著减少(p<0．05)，而0。125mmol／LPA、OA组骧鑫素分泌量无漫著降低(P>O，05)：低糖及高糖刺激下AA各浓度组胰岛素分泌量无嫩著减少(P>O．05)；缀间比一。较，高糖刺激下0．5nmol／LPA组与相同条件下0．5mmol／LOA组胰岛素分泌量相比显著减少(P<0．05)。0．25mmo

7、FLPA作用胰岛细胞不同时间(0、24h、48h、72h)动态观察结果显示，PA作用胰岛细胞48h后，高糖刺激下的胰岛素释放量显著降低(P<0．05)。3、不同浓度PA作用胰岛细胞48h，Hoechst33342／PI双染荧光显微镜下观察结果：部分细胞核呈兰色，可见核碎裂，提示为早期凋亡细胞；部分细胞核为红色，可见核碎裂及凋亡小体，提示为晚期凋亡细胞；部分细胞核均匀红色或为弥散红色，提示为死亡细胞。电镜观察到PAO．25mmol／L、0．5mmoFL组细胞核染色质边集，固缩、凝结成块，部分细胞核崩解、碎裂，胞质内大量空泡变性，可见自噬体、多胞体，细

8、胞器超微结构紊乱：PAO．25mmoYL、0．5mmoFL组琼脂糖凝胶电泳图呈典型的DNA梯状(1adder)带。West