表观遗传调控在涡虫再生中的功能及机制研究

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1、密级中国科学院大学UniversityofChineseAcademyofSciences博士学位论文塞塑选篮调控查堡虫要塞虫笪盐篚壁担劐殛宜作看姓名：曾窭指导教师：荆渣砸塞虽学位类别：理堂蠖±学科专业：生物丝堂皇佥王生整堂培养单位：生国抖室医上壹生佥科堂匠盎瞳隆鏖柱兰匠巍匾2013年4月24日EpigeneticregulationofplanarianregenerationByAnZengADissertationSubmittedtoGraduateUniversityofChinese

2、AcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofBiochemistryandMolecularBiologyInstituteofHealthSciences，ShanghaiInstitutesforBiologicalSciences，ChineseAcademyofSciencesApril24，2013lIlll[IIlllIUllUIIIY2431040摘要表观遗传调控在涡虫再生中的

3、功能及机制研究曾安(生物化学与分子生物学)导师：荆清研究员动员体内成体干细胞使其参与修复损伤或者衰老的组织一直是再生医学的目标。几个世纪以来，发育生物学家就注意到自然界中存在很多生物能够通过不同的方式再生出缺失的组织，但人们对再生的细胞及分子机理依然知之甚少。一个重要的原因是大多数经典模式生物的再生能力都非常有限，而且在体地研究干细胞的行为比较困难。淡水涡虫由于体内丰富的成体干细胞的存在而具有强大的再生能力，代表一个非常有潜力的用于研究干细胞和再生的模式生物。近年来，涡虫基因组测序基本完成，遗传

4、学和细胞生物学工具逐渐成熟，其体内干细胞及子代细胞的分子标记和调节因子得到了初步确认，再生过程的变化基因得到了鉴定，涡虫正逐渐成为一个独特的用于探索成体干细胞调控机制及其参与再生机理的模型。表观遗传(epigenetics)调控是指不改变DNA序列的情况下，使基因表达发生可遗传的改变的调控方式。它主要包括DNA的甲基化修饰，组蛋白的修饰及染色质重塑因子的调节等。表观遗传机制对干细胞自我更新和多能性的调控研究是干细胞领域的热点前沿，但是表观遗传对成体干细胞及其参与再生机制的调节研究尚不多见，其相关

5、的机制并不明确。为了系统性地研究表观遗传因子在涡虫再生中的功能，我们分析、鉴定并克隆了涡虫中205个染色质相关蛋白，通过RNAi(I矾A干扰)敲低逐个研究它们对再生的影响。我们发现12个染色质相关因子对涡虫再生是必需的。进一步通过分别纯化涡虫成体干细胞和分化细胞，结合定量PCR分析它们在成体干细胞中的相对表达水平，发现这12个基因主要富集表达在涡虫成体干细胞中。通过对成体干细胞和分化细胞标志基因的表达水平的检测，我们发现这12个基因都参与了调节成体干细胞的自我更新或者多能性的维持中，提示它们主要

6、通过调节成体干细胞的特性进而参与到再生过程中。重要的是，涡虫成体干细胞中的表观遗传网络与高等生物多能干细胞的表观遗传调控网络有较高的保守性。我们进一步克隆并鉴定了涡虫的两个异染色质蛋白(HPl)编码基因，并将它们命表观遗传调控在涡虫再生中的功能及机制研究名为HPl．1和HPl．2。出乎意料的是，HPl—1基因特异性地表达在涡虫成体干细胞中。当HPl．1被敲低后，干细胞自我更新受到抑制并导致其过早分化，最终减少干细胞数量，使得涡虫不能维持身体的稳态。而在涡虫受到损伤时，HPl．1表达水平上升。当抑

7、制HPl．1的表达时，干细胞的再生增殖能力受阻，涡虫不能再生出芽基。而HPl．2敲低对涡虫再生无明显影响。进一步采用基因芯片分析HPl．1敲低后，涡虫再生受阻时的基因表达谱式，我们发现HPl．1维持了干细胞特异的表达谱式——促进增殖基因的表达而抑制分化基因的激活。进一步我们发现再生过程中HPl．1与FACT复合体相互作用参与到基因活化中。通过芯片分析结合RNAi筛选，我们发现Mcm5可能是HPl．1的一个下游靶基因。采用我们建立的整虫染色质免疫沉淀技术，发现再生过程中HPl．1蛋白的确能够结合到

8、Mcm5启动子区域，促进Mcm5的上调，提示HPl．1通过上调增殖相关的基因Mcm5的表达而促进涡虫成体干细胞的再生增殖。综上，本研究通过RNAi功能筛选，首次在涡虫中系统性地研究了表观遗传因子和涡虫再生的关系；通过我们制备的抗体、芯片和建立的整虫ChIP实验，第一次深入地揭示了染色质调节因子调控涡虫干细胞行为和再生的机理，并发现HPl．1作为关键染色质调控因子促进成体干细胞的再生增殖。本研究丰富了表观遗传学调控的功能及其调控机制，提示涡虫可以作为一个非常有前景的模型用于研究成体干细胞介导再生中