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1、1.实时荧光定量PCR技术原理及特点实时荧光定量PCR是将荧光能量传递技术(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)应用于常规PCR仪中,指在PCR反应体系中加入荧光基团或荧光染料,利用荧光信号积累,从而实时监测整个PCR过程,最后通过标准曲线对未知模板浓度进行定量分析的方法。1.1基本原理在实时荧光定量PCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和
2、最终的平台期。FQ-PCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。域值→Ct↑如果检测到荧光信号超过域值则被认为是真正的信号,它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct(cyclethreshold)值的含义是:每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。研究表明,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,Ct值随着起始模板量的增加而线性降低,利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线。其中横
3、坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。1.2化学反应原理依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种:(1)SYBR荧光染料:SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。(2)TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。PCR扩增时在加入一对引物的同时
4、加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。1.3特点一般PCR产物都需要经过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭（EB）染色紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测,不仅需要多种仪器,而且费时费力,所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害处,在这繁杂的实验过程中会带来假阳性的污染。而荧光定量PC
5、R克服了常规PCR的许多缺点,有着如下显著的优点:(1)特异性好。使用针对靶序列设计的特异性探针对定量分子进行识别,具有很高的准确性。同时,靶序列由引物和探针双重控制,特异性好、假阳性低。(2)灵敏度高。荧光定量PCR检测技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术,因此大大提高了其检测灵敏度。(3)线性关系好、线性范围宽。由于荧光信号的产生和每次扩增产物成一一对应的关系,通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。(4)操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测在全封闭的同一管内检测,不需要开盖,降低了溴化乙锭的污染。同时扩增和检测一步完成
6、,不需要后期处理,不再需要担心放射性污染。(5)速度快、效率高。可在2-3小时完成多个样品的定量分析,有效的减少了劳动量。↑Ct→域值SYBR染料TaqMan探针
