Westernblot实验步骤

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1、Westernblot实验技术辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663Westernblot原理WesternBlot采用的是变性聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离蛋白质混合物，经过SDS-PAGE分离的蛋白质被到转移到固相支撑物（NC膜，PVDF膜等）上后，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持膜上蛋白质或多肽的抗原性质不变，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与其对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的二抗体起反应，经过底物显色以检测特异蛋白质表达水平。由于Westernblot检测技术具有简便，快捷等特点

2、，所以目前该技术也被广泛应用于蛋白质表达水平的检测。辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663WesternBlot信号放大基本原理经过SDS-PAGE分离的蛋白质、多肽等被转移到固相支持膜上，然后用蛋白质或多肽特异性的抗体来检测一级信号放大二级信号放大一抗抗原抗原一抗二抗辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663WesternBlot一般流程底片扫描、分析底物显色二抗孵育一抗孵育封闭转膜SDS-PAGE电泳蛋白样品的制备辉骏生物：http://www.fitgene

3、.com/免费服务热线：400-699-1663WesternBlot基本实验步骤1、蛋白质提取：WIP或RIPA裂解细胞或研磨组织，离心，收集上清。2、蛋白定量：先总蛋白定量，western后在依据内参定量。3、电泳：依据需要检测蛋白的分子量选取胶的浓度，制胶，电泳。4、转膜：半干或湿转，应用半干法转膜需防止短路。5、封闭：5%脱脂奶粉或BSA封闭过夜或室温1小时。6、一抗孵育：5%脱脂奶粉稀释一抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时或4度过夜，1xTBST洗膜3次，每次5分钟。7、二抗孵育：5%脱脂奶粉稀释二抗到合适的浓度，与膜室温孵育1小时，1xTBST，洗膜3次，每

4、次5分钟。8、显影(ECL法)：将A、B发光液按比例稀释混合均匀滴在膜上。置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干。9、图片分析：标定Marker，进行分析与扫描。辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663贴壁细胞：细胞可以在培养皿里裂解，洗掉培养基，PBS洗2~3次，加入RIPA裂解液裂解，以可以将细胞消化下来，离心，PBS洗2~3次，加入RIPA冰上裂解液裂解30分钟（可提高蛋白浓度）。按

5、6孔板100-200微升/孔的比例加入PIPA(可根据细胞多少调节裂解液体积）,4度，12000转，离心15分钟，收集上清.悬浮细胞:收集培养细胞，离心去除培养液，用PBS洗2-3遍，按6孔板加入100-200微升/孔的比例加入RIPA，用抢悬浮细胞。如果细胞数量较大，应按50-100万细胞/管分装或根据细胞数量按比例增加RIPA的用量，裂解完全时应无明显的细胞颗粒。4度，12000转，离心15分钟，收集上清.组织样品：液氮研磨组织，按每20毫克组织加100-200微升的比例加入RIPA,冰上裂解30分钟，4度，12000转，离心30分钟，收集上清.蛋白样品的制备辉骏生

6、物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663蛋白样品的定量Bradford法测定蛋白浓度原理：此法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。考马斯亮兰溶液的配制：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%(W/V)磷酸，将溶液用水稀释到1000mL，过滤。试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G250，4.

7、7%(W/V)乙醇，和8.5%(W/V)磷酸。实验步骤：96孔板，对照20μlPBS,测定蛋白样品:18μl+2μl蛋白，加入200μl考马斯亮兰溶液，放置2分钟（在一个小时内测，时间变长，可能会产生沉淀），酶标仪上595nm处测定吸光值，这样只能相对定量蛋白，如果要定量蛋白，可以用不同梯度的BSA做标准曲线来定量蛋白辉骏生物：http://www.fitgene.com/免费服务热线：400-699-1663SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：SDS是一种阴离子表面活性剂.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质