Westernblot实验原理和实验步骤.ppt

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1、Westernblotting基本原理和实验步骤为什么要做蛋白质印迹实验？研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。目录1Westernblot基本原理2蛋白免疫印迹的组成3Westernblot一般流程4Westernblot常见问题分析1WesternBlot基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如PVDF膜上。固相载体可以吸

2、附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA或脱脂奶粉溶液）处理，封闭PVDF膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理PVDF膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的PVDF膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。2组成蛋

3、白免疫印迹（Westernblotting或Immunoblotting）一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。第一步:是做SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。第二步：把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，电转移主要方法有垂直的槽式和水平的半干式两种。第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫

4、酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。3Westernblot流程图WesternBlot一般流程1蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交洗膜二抗杂交洗膜底物显色蛋白样品的制备21、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ulPBS混匀，500g离心5min。去掉废液加

5、入15ulPBS再加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。2、分泌蛋白的提取：取15ul细胞上清，加入5ul5Xloadingbuffer，100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳4分离胶浓度与蛋白分离范围5制胶1）装好架子，固定好玻璃板。2）注水试漏。3）倒水，甩干，用滤纸吸净残留水份。4)按照下面配方配制12%分离胶。一般1.5玻璃板需胶6.5-7ml，1.0玻璃板需胶4.5ml。5)将胶慢慢倒入，防止有气泡产生。6）在胶上面加入一层蒸馏水，可以将胶里的气

6、泡压出、将胶面压平并防止顶层胶风干。7)待分离胶凝集后（至少20度，30min），配制浓缩胶5％。6制胶过程注意事项操作时要使两玻璃对其，以免漏胶加完分离胶后，加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。分离胶充分凝固就倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。插梳子时要使梳子保持水平。7上样与电泳将制备好的样品溶解后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。浓缩胶用70V电压，当样品至分离胶时，用120V电压，至溴酚兰跑到底时停止电泳。电泳时常遇到的问

7、题︶条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。8转膜在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。膜的选择：印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。有两种规格：Immobilon-P（0.45

8、um）和Immobilon-PSQ(0.2umforMW<20kDa)。槽式湿转法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中