斜带石斑鱼哈氏弧菌疫苗研究

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1、上海水产大学硕士学位论文斜带石斑鱼哈氏弧苗研究姓名：陈献稿申请学位级别：硕士专业：水产养殖指导教师：吴淑勤;石存斌2003.6.1陈献稿上海水产大学硕士学位论文中文摘要斜带石斑鱼哈氏弧菌疫苗研究摘要斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)为海水名贵鱼类，是我国南方地区网箱养殖鱼类主要品种之一，但养殖过程中死亡率较高，其中弧菌病引起的溃疡病是一种常见病和多发病，常造成严重的经济损失。作者从自然患病斜带石斑鱼肝脏中分离到一株致病菌，编号为EcGY020401。用该株病原菌人工感染斜带石斑鱼，实验鱼出现尾鳍溃烂、体表溃疡等与自然发病相似的症状。经细菌快速鉴定仪

2、鉴定为弧菌，细菌学常规检测结果符合哈氏弧菌的特征；通过16SrRNA测序并经序列匹配分析，确认为弧菌属哈氏弧菌(Vibrioharveyi)。经查新，为在中国大陆首次从斜带石斑病鱼中分离到哈氏弧菌。腹腔注射攻毒，按照Reed．Muench法计算，该菌对斜带石斑鱼的半数致死剂量(LD50)为2．7×100cfu／g鱼体重。作者采用温酚法从哈氏弧菌EcGY020401株菌体提取了粗脂多糖(粗LPS)，采用硫酸铵分级盐析提取了其粗胞外产物(胞外产物A)。此外，对粗LPS和胞外产物A、提纯的胞外产物和脂多糖(LPs)的一些特性进行了分析。结果表明，胞外产物A(4ug／g)对

3、斜带石斑鱼有致死作用，而注射粗LPS(4pg／g．1}时斜带石斑鱼无异常；胞外产物A对小白鼠红细胞溶血作用最强，对人O型血红细胞无溶血作用，对斜带石斑鱼有溶血作用；1％琼脂平板法检测胞外产物A具有淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶活性。这些结果显示有可能可通过接种粗ECP疫苗预防弧菌病；制各粗ECP疫苗时应该对胞外产物A进行灭活，而粗LPS陈献稿上海水产大学硕士学位论文中文摘要在制备疫苗可以不用灭活。纯化的ECP、LPS按laemmli法不连续SDS．PAGE，前者经考马斯亮蓝R一250染色，显示为3条带，分子量依次约为33KD、23KD、20KD．其中的33KD与李国诰等(

4、2002)从鲨鱼弧菌(即哈氏弧茵)分离、纯化到一条主带为33KD(丝氨酸蛋白酶)～致；后者经氨银法染色，为片状快速迁移带，与报道的脂多糖相似。为研制有效的预防斜带石斑鱼哈氏弧菌病疫苗，作者分别制备了福尔马林灭活的全菌疫苗(简称FKC苗)、粗ECP苗、粗LPS苗。安全性试验结果表明，FKC苗5．0X107cfu／g(10倍于实际免疫接种剂量)、粗LPS苗60ug／g(1．5倍于实际免疫接种剂量)、粗ECP苗10pg／g(1．2倍于实际免疫接种剂量)体重的剂量注射接种，对斜带石斑鱼安全可靠。考虑到养殖生产中实际情况，采用不同途径和方法，对FKC苗、粗ECP苗、粗LPS苗

5、的免疫效果进行比较试验。结果表明：1)哈氏弧菌FKC苗、粗LPS疫苗、粗ECP疫苗均能刺激斜带石斑鱼幼鱼产生体液免疫应答，获得免疫保护效果，初步证实了采用疫苗防治斜带石斑鱼弧菌病是一条可行方法；2)三种疫苗的免疫效果顺序依次为FKC苗>粗ECP苗>粗LPS苗，注射途径效果好于浸泡免疫，其中FKC苗采用腹腔注射的方法获得的免疫保护力最强(>79％)；3)粗ECP苗、粗LPS苗等亚单位疫苗采用浸泡法，在加强免疫时也显示出较好的免疫保护作用；4)利用莨菪碱作为增效剂，可显著提高哈氏弧菌FKC苗浸泡免疫时保护效果(卡方检验，P<0．05)：利用淡水预处理鱼体再浸泡疫苗方法取

6、得较好的免疫保护效果。评价：本实验条件下，FKC苗效果最好，成本低廉，制作简单，陈献稿上海水产大学硕士学位论文中文摘要易于工，一化生产；虽然注射免疫效果好于浸泡，但操作烦琐、工作量大，效率较低，注射部位易出现感染；相比之下，利用莨菪碱作为增效剂和淡水预处理后浸泡疫苗方法对鱼体无损害，具备安全有效、方便、快捷，省力优点，适合于大批量幼鱼进行免疫。此外，淡水预处理后浸泡鱼体疫苗方法，达到既预防弧菌病又兼顾预防海水鱼寄生虫病效果，实用性、针对性较强，有广泛的应用价值。从长远来看，浸泡型哈氏弧菌FKC苗在应用免疫防治斜带石斑鱼弧菌病方面具有诱人的市场前景。关键词：斜带石斑鱼

7、，啥氏弧菌，脂多糖，胞外产物，疫茁陈献稿上海水产大学硕士学位论文英文摘要StudiesoilvaccinesagainstVibrioharveyiinestuarycod(Epinepheluscoioides)AbstractEstuarycod，Epinepheluscoioides，isacommonlyculturedmarinefishinthesouthofthePeopleSRepublicofChina(PRC)．However,onemajorobstacleencounteredinitsintensivecultureisitsfrequ