哈氏弧菌（vibrio harveyi）谷胱甘肽抗氧化系统与耐药的相关性研究

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1、分类号：Q786密级：公开UDC；579学号：2111201104广瘃海洋太旁硕士学位论文哈氏弧菌（册咖Aarv如）谷胱甘肽抗氧化系统与耐药的相关性研究朱帆指导教师：丁燏教授串请学位类别：理学硕士专业名称：海洋生物学研究方向：水产经济动物免疫学及病害控制学院名称：水产学院中国•湛江2015年6月旁住资弍答辨奏夷会板成挪：时间：o^/T.工广东海洋大学学位论女原创性声明:本入辞重声朗：所呈耷的论文是本人在导师的指f下独聋进行研究所氣得的研究®果•除了龙中赞别加以标痒弓丨用敢内容外，本论文不包含任W其

2、芦个人與藥体&经发表或撰写的成東作^対本支的研究做出童案贡-的个人和_，均已在文中以明确方武标明。本入寒全倉识到本声明的法律后果由本人承担•作者签名:物3〇丨$年^•月f

3、曰学位论文版权糊授权书本学偉论文作者完全了解学校眘关葆留'使辑的姨定，同意举校為留并向国家有关部门或P构送&法宇g论;t被查阅和借阒•本人按权广岽海洋大学可以蘇i学每每文的余部或部分内容编入有库进行检索，可以来用-印、^印或扫揮等复制手段保存和汇编辟位论文.本学位论文属于1、保密口，在年k密后适用本授权书6不保密E^。(请在以上

4、相应方框内打‘十）作者签名：汾丨y年y月?）曰导师签名：_>/f年月J)日哈氏弧菌（Vibrioharveyi）谷胱甘肽抗氧化系统与耐药的相关性研究摘要哈氏弧菌是水产养殖经济动物的条件致病菌，大量使用抗生素控制弧菌病导致弧菌的耐药性和耐药菌数目日益增多，使弧菌病的控制变得更加困难，给水产养殖业带来巨大的经济损失。关于致病菌耐药机制的研究发现，抗生素作用于致病菌时会引起细胞内的氧化应激，从而损伤或杀死细胞，因此抗氧化系统通过对ROS的清除成为一种致病菌耐药形成的非经典机制。本研究以哈氏弧菌ZJ060

5、3基因组DNA为模板，通过同源引物克隆、分析了哈氏弧菌gs、gcs和gr基因。结果表明，gs基因有951bp的ORF，编码316个aa，预测其相对分子量为35.19kDa；gcs基因有1335bp的ORF，编码444个aa，预测其相对分子量为50.37kDa；gr基因有1356bp的ORF，编码451个aa，预测其相对分子量为48.90kDa；Blast分析发现哈氏弧菌gs、gcs和gr基因与副溶血弧菌同源性分别为99%、91%和98%，与溶藻弧菌分别为98%、90%和98%。分别构建了三个基因的

6、原核表达载体pET-gs，pET-gcs和pET-gr，并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达。在最佳表达条件下测定三株重组菌对强力霉素和诺氟沙星的药物敏感性变化，结果表明重组菌对强力霉素的耐药性增强。利用药敏试验和试管二倍稀释法筛选出分别对两种抗生素具有抗性的耐药菌，运用RT-PCR技术，分析了敏感菌和耐药菌中GSH抗氧化系统相关基因的相对表达量。结果显示，各基因在耐药菌中的表达量显著高于敏感菌。采用分光光度法分别测定敏感菌和耐药菌GSH抗氧化系统相关酶的活性和GSH含量，结果表明同一菌株

7、在筛选前和筛选后的酶活性和GSH含量具有显著差异，即耐药菌的酶活性和GSH含量显著高于敏感菌。敏感菌和耐药菌在抗生素的刺激下OH·含量和酶活性均发生显著变化，且敏感菌的OH·含量和酶活性增加倍数高于耐药菌，表明抗生素刺激引起细胞内的氧化应激，耐药菌不容易受到氧化损害。通过胞外添加GSH或GCS抑制剂BSO后比较不同细菌药物敏感性的变化，以进一步验证它们的功能。结果显示，添加GSH后敏感菌和耐药菌对诺氟沙星的耐药性增强，GSH相关酶酶活性升高；添加BSO后敏感菌和耐药菌的GCS酶活性降低，对诺氟沙星

8、的耐药性降低。总之，诺氟沙星和强力霉素能够引起哈氏弧菌的氧化应激，哈氏弧菌GSH抗氧化系统与其对这两种药物耐药性的形成存在一定相关性。关键词：哈氏弧菌耐药性谷胱甘肽抗氧化系统活性氧BSOIStudyontherelationshipbetweenglutathioneantioxidantsystemandantibioticresistanceinVibrioharveyiAbstractVibrioharveyiisaconditionedpathogenofaquaticanimals.Ex

9、cessuseofantibioticstocontrolvibriosis,however,leadtothedrugresistanceofvibriosisaswellasaincreasingnumberofdrug-resistantbacteria,whichcausedhugeeconomiclossestoaquaculture.Thus,diseasecontrolhasbecomemoredifficult.Studiesontheresistantmechan