腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究

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1、中国医科大学博士学位论文腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究姓名：罗涛申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：张强2002.9.1腺病毒介导的转自杀基因抑制移植静脉内膜增生的实验研究中文摘要目的动脉粥样硬化常导致心血管和肢体血管狭窄或闭塞，有较高的致死、致残率，严重威胁患者的健康。自体静脉移植，重建动脉循环通路，是经典的治疗手段，可以有效地减轻症状、延长生命。但是静脉移植物在术后易形成新生内膜，使其在术后10年约有40％“0％发生狭窄和堵塞。提高移植静脉术后通畅率成为血管外科亟待解决的问题。目前研究表明，移植静

2、脉狭窄的主要原因是移植静脉内膜增生，内膜增生是血管平滑肌细胞增生迁移的结果。抑制平滑肌细胞增生成为防治移植静脉狭窄的焦点。药物治疗移植静脉狭窄很不理想，往往因为系统给药毒副作用大而在临床上受到限制。现在随着基因技术的发展，基因治疗成为解决这一难题的希望。自杀基因系统最早应用在肿瘤的治疗中，取得了较好的效果。在动脉损伤再狭窄的研究中，转染自杀基因TK可显著地抑制平滑肌细胞增生，减轻新生内膜造成的血管腔狭窄，但纵观文献，自杀基因的在静脉系统中的作用如何，尚未见报导。针对细胞增生为特点的病理改变，本实验拟采用自杀基因系统抑制移植静脉

3、内膜增生。方法本实验采用大隐静脉培养和大鼠静脉移植作为实验模型，模拟内膜增生病理变化。实验中首先应用腺病毒载体携带标记基因LacZ，研究大隐静脉和大鼠移植静脉中转基因的效率、靶细胞和表达时效。然后以TK基因为治疗基因，以腺病毒为载体转染人及大鼠的静脉，在培养液或大鼠体内注人丙氧鸟苷，观察静脉内膜是否受到显著的抑制。体外转基因：将静脉剖开，内膜暴露，自然浸入病毒载体溶液中。然后将静脉横断成0．5cm的片断，随机分到各组，将静脉片置于培养皿中培养，隔日换培养液，培养至取材。为提高中膜平滑肌细胞的转染率，本实验探讨了机械牵拉、静脉腔

4、内灌注转基因的方法。在体转基因：Wister大鼠经腹腔麻醉后，取颈部中线切i]，暴露颈静脉及其分枝。用显微血管夹钳夹颈静脉的两端，微量注射器从静脉侧枝的横断切口插入。静脉管腔用RPMll640的肝素水轻轻冲洗去残留血。病毒液注入管腔，使其充盈。室温下孵育30分钟后。对照组松钳后恢复静脉的血流。实验组则将颈静脉进行结扎，切除，作为移植物进行颈动脉问位移植术。移植术后3，14，21天取标本。以相同条件在静脉中转染自杀基因TK。标本处理：培养的大隐静脉片或移植的颈静脉，经常规处理后切片，进行苏木素一伊红(HE)染色、Verhoeff

5、弹力纤维染色(VG)，辅以计算机图像分析观察内膜增生程度。进行PCNA免疫组织化学染色，测定平滑肌细胞增生指数。大隐静脉常规石蜡切片，行抗内皮细胞相关Ⅷ因子及平滑肌细胞d一肌动蛋白免疫组织化学染色，鉴定静脉中细胞成分，以扫描电镜观察静脉的通透性变化。静脉组织经X—gal染色检测静脉中基因转染及表达效率，并对阳性细胞种类进行鉴别。取3天时的大鼠颈静脉进行ICAM一1，VCAM一1免疫组化染色，观察移植静脉炎性改变。测定各时点大鼠转基因静脉中8一半乳糖酶活性。以原位杂交和PCR为手段鉴定转TK基因成功并且表达。测定心、肺和脑等重要

6、脏器的半乳糖酶活性和自杀基因的存在。结果实验中观察到腺病毒载体的靶细胞广泛，大隐静脉的内皮细胞和平滑肌细胞均可被转染。内皮细胞转染率与腺病毒载体作用的时间长短有关，10rain即可转染上标记基因，较长的孵育时间可获得较高的转基因效率。中膜的平滑肌细胞也可被腺病毒载体转染，但转染率较低。为提高中膜平滑肌细胞的转基因效率，本实验使用机械牵拉及灌注加压的方法，使中膜平滑肌细胞的转基因效率明显提高，同时实验表明，内皮细胞并未因此而受到损伤。实验中对大鼠移植静脉及正常静脉转染腺病毒介导的B一半乳糖酶基因，然后在3，14和21天后测定半乳

7、糖酶的活性。3天后，腺病毒有效地转染内皮细胞及中膜平滑肌细胞。转基因的移植静脉与转基因的正常静脉相比较，移植静脉内皮细胞大量表达VCAM一1，ICAM一1，炎性反应明显。·2·移植静脉中半乳糖酶的活性为正常静脉的70％，其活性下降明显。第14天时，所有静脉ss夕t．源基因表达效率都降低，在移植静脉中更为明显，与正常静脉相比差异显著。在术后2l天，所有静脉中均无半乳糖酶活性表达。移植静脉中的内皮细胞容易受到动脉血流及炎性反应的影响，阳性细胞损失明显，这是半乳糖酶活性降低的一个重要原因。中膜的平滑肌细胞由于受到解剖屏障的保护．阳性

8、细胞损失率并不显著。中膜平滑肌细胞转基因藉可较长时间稳定地表达外源基因。培养静脉及移植静脉14天时，内膜明显增厚，此时平滑肌细胞增殖最为显著。通过PCR及原位杂交证明腺病毒叼以将胸苷激酶基因转染人的大隐静脉及大鼠自体移植静脉并能够表达mRNA，在对照组中转半乳糖酶基因的静脉中