新型人降钙素基因在大肠杆菌中的表达

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1、天津医科大学硕士学位论文新型人降钙素基因在大肠杆菌中的表达姓名：剧海申请学位级别：硕士专业：生物化学与分子生物学指导教师：张镜宇20030601中文摘要降钙素是一种重要的肽类激素，在肌体的钙磷代谢，骨的形成、分化和发育等相关的诸多环节中起着关键性作用。降钙素在临床上应用十分广泛，但其自然来源有限，必须以基因工程手段进行大规模生产才能满足需求。原核系统中表达出的降钙素无法完成C．末端的酰胺化，尚需体外处理才能具有较强的生物活性。本文利用PCR技术扩增新型人降钙素基因编码序列hCT+(将编码C-末端脯氨酸的密码子换为编码谷氨酰氨的密码子)，将此

2、基因克隆入大肠杆菌非融合型表达载体pBV220及融合型表达载体pET42a中。重组表达载体pET42a／hCT*转化到大肠杆菌BL21(DE3)plys中诱导表达，经SDS．PAGE证实细胞裂解物中含有与预期位置相同的融合蛋白，经WesternBlot鉴定证明此融合蛋白具有人降钙素的免疫活性。表达条件优化后，可溶性蛋白的表达量占胞内总蛋白的10％。经超滤浓缩后，融合蛋白在Xa因子作用下产生重组的新型降钙素，进一步分离纯化得到该蛋白的初级纯品。大鼠体内降血钙试验表明新型降钙索具有降血钙活性。关键词：新型降钙素大肠杆菌表达AbstractCal

3、citoninisoneofimportantpeptideregulatoryhormones，playdsimportantrolesinmetabolismofcalciumandphosphorousandinvolvesindevelopmentanddi恐rentiationofbone．TheencodingfragmentsofnovelhCTgene(ProlinecodonweredisplacedbyGlutamincodon)wasamplifiedbymeansofPCR，andWaSinsertintofusio

4、nexpressivevectorpET42a．TherecombinantexpressivevectorpET42a／hCT+WaStransformedintoE．coliBL2l(DE3)plysS．InducedwitllIPTG，thecellsproducedaproteinwitIlamolecularweightofabout34kDonSDS-PAGEgel．TheproteinhastheimmunogenicityofhumancalcitoninverifiedbyWestemBlotanalysis．Aftero

5、ptimizationofcondition，fusionproteinWaSconcentratedbyultrafiltrationandcleavedbyfactorXa，thenrecombinantnovelhCTwasobtained．Finally,weconfirmedthatthenovelhCThasthehypocalccmicbioactivityinrats．KeyWords：novelhamancalcitoninE．coliexpressing2前言降钙素是一种由32个氨基酸组成的分子量约3500Da的肽类激素

6、，1962年由Copp等⋯首先发现。在哺乳动物中降钙素是由甲状腺C细胞分泌的，在低等脊椎动物(如鲑鱼)中由后鳃体产生。不同种类的CT均由32个氨基酸组成，其N．端7个氨基酸中除第二位不同外，其余完全一致，Cysl与Cys7间形成二硫键，c．末端均为脯氨酰胺[21。CT肽链的完整性为其生物活性所必需，缩短肽链可丧失几乎全部的活性，去掉第16位的氨基酸或氧化第8位的甲硫氨酸均失去大部分活性‘31。C末端的酰胺化对其活性影响很大，脯氨酰胺去酰胺化为脯氨酸将降低其生物活性[4】a第8—22位氨基酸残基所构成的双亲Q一螺旋区对活性(受体结合能力及降低

7、血钙能力)极为必要，其内部的氨基酸残基的区段构象也显著影响着生物活性，具体机制尚不十分清楚。目前认为其17-21位氨基酸残基所构成的13折叠／15转角构象与最初的受体识别相关，而a-螺旋空间构象与受体结合过程相关[5,61，17位天冬酰胺侧链的拓扑结构也与活性密切相划71。如果CT氨基酸组成具有较强的亲水性和较高的净正电荷，则活性较强。由于糖基化作用可致使降钙素活性降低，其3．5位氨基酸残基所构成的糖基化位点也与活性密切相判81。不同来源的CT氨基酸组成及生物活性差别很大，人与大鼠之间、鱼与禽类之间、猪、牛、羊之间具有极高的同源性，其中鱼类

8、与禽类CT的活性较高，鲑鱼CT活性约为人CT的40．50倍，它有三种同功体，而I型的活力最高。降钙索主要的靶器官是骨组织和肾脏，可抑制破骨细胞的骨吸收作用和肾小管上皮细胞对钙、磷