链霉菌几丁质酶基因分子检测及克隆

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1、河北农业大学硕士学位论文链霉菌几丁质酶基因分子检测及克隆姓名：刘力强申请学位级别：硕士专业：植物病理学指导教师：刘大群2003.6.1摘要本研究选用本实验室分离保存的25株生防链霉菌菌株，使用生物测定方法检测到14株能够裂解几丁质；以已克隆的17株链霉菌几丁质酶基因的保守序列为基础，使用DNAStar软件设计了一对引物；应用PCR方法对这14株链霉菌的几丁质酶基因进行了分子检测，其中有11株扩增出了特异性的约480bpDNA片段，对其中两株的扩增片段测序，并进行Blast分析，所得片段与砌印吣∞coelicolor的劭以基因同源性

2、达到了91％以上。此方法相对于几丁质酶的传统生物学检测，具有更好的准确性和灵敏性：而且与生物学检测相比，使用分子检测省时省力。由此证明分子检测可以作为从土壤中筛选产生几丁质酶链霉菌的有效方法。在分子探测基础上，对其中一株链霉菌$93的几丁质酶基因进行了克隆。使用Sau3AI对基因组DNA进行不完全酶切，回收2～3kb片段，与pUCl8质粒连接转化大肠杆菌，利用地高辛标记探针，使用菌落原位杂交筛选转化子：筛选到包含有约lkb外源片段的转化子。关键词：链霉菌，几丁质酶，分子探测，$93，基因克隆独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人

3、在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得i雪些壁垒量鲎或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者署名：知)力兹签字日期：D3年上月旧日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解I酉丝鬈垃《有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权a§2丝缝g盏霉可以将学位论文的全部或

4、部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫插等复锚手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后使用本授权书)学位论文作者签名：方l为蕴签字日期：驴，年于月阿日学位论文作者毕业去向：工作单位：通讯地址：电话：邮编：河北农业大学硕士学位论文文献综述几丁质(chitin)又称几丁、甲壳素、甲壳质、蟹壳素、明角壳蛋白、甚至是壳多糖，几丁质是由N一乙酰．2．脱氧一口葡萄糖以B．1，4糖苷键连接而成的直链多糖⋯。从结构式可以看出，如果将几丁质糖基上的乙酰氨基(CH3C-NH-)换成羟基(一OH)，则便是纤维素了。几丁质是广泛分

5、布于自然界的生物多聚物，自然界每年生成的几丁质约有一百亿吨，在天然聚合物中的贮量占第二位，仅次于纤维素。几丁质亦是自然界中除了蛋白质以外数量最大的含氮天然有机物：所以几丁质在自然界有着非常重要的作用。几丁质分布广泛，大致有这几方面：(1)节肢动物，主要包括甲壳纲(如虾、蟹等，含几丁质高的达28％---85％)、昆虫纲(如蝗、蝶、蚊、蝇等，几丁质含量为20％,-60％)、多足纲(如马陆、蜈蚣等、蛛形纲(如蜘蛛、螨等，几丁质含量为4％~22％)；(2)软体动物，主要包括双神经纲(如石鳖)，腹足纲(如蜗牛)、掘足纲(如乌贼)等，几丁质含

6、量3％~26％。(3)环节动物，包括原环虫纲(如角蜗牛)、毛虫纲(沙蚕、蚯蚓)和蛭纲(蚂蝗)三纲，有的几丁质极少，高的含有20％一38％。(4)原生动物，简称原虫，也叫单细胞动物，包括鞭毛虫纲(如锥形虫)、肉足虫纲(如变形虫)、孢子虫纲(如原虫)、鞭毛虫纲(如草履虫)等。(5)腔肠动物，包括水螅虫纲、珊瑚虫纲等，一般含量很少，但也有的达到了3％—，30％。(6)海藻，主要是绿藻。河北农业大学硕士学位论文(7)真菌，包括囊菌、担子菌、藻菌等、含有几丁质从微量到45％不等只有少数的真菌如Olmycetes和Trichomyctes不含

7、有几丁质。(8)动物的关节、蹄、足等坚硬的部分。世界各国每年在南极地区捕获的水虾类的甲壳类动物高达l～5X108吨(2'31,不过它们含几丁质较少，只有O．33％～1．74％【4】。表列出了一些有代表性的真菌中的几丁质的含量口，5·“。表1真菌几丁质的分布和含量种类含量(％)黑霉40．2。青毒霉18．5。黄毒霉20．I。啤酒酵母2．9c毛霉44．56蘑菇19I注：a：湿重：b．干重；c细胞壁干重由表1可以看出在真菌中几丁质含量很高，在真菌中几丁质作为大多数真菌细胞壁的主要成分之一，起着细胞骨架的作用，对真菌的正常生理代谢和维持正常

8、的生命活动起着重要的作用。目前已知菌丝顶端细胞中几丁质合成能力最强。几丁质在几丁质酶系作用下分解成几丁质单糖一一对乙酰氨基葡萄糖(NAO)。几丁质酶系包括几丁质r晦(chitinase，EC3．2．14)和几丁质二酶(ehitobisae，EC3．