大肠杆菌O157VT噬菌体及VT毒力基因的研究

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1、上海交通大学硕士学位论文大肠杆菌O157VT噬菌体及VT毒力基因的研究姓名：张慧英申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：严亚贤;孙建和20050101大肠杆菌O157VT噬菌体及VT毒力基因的研究摘要大肠杆菌O157:H7是肠出血性大肠杆菌的主要血清型可引起人与动物的腹泻出血性肠炎严重者可并发溶血性尿毒综合征血栓形成性血小板减少性紫癜致死率高尽管对O157致病机制尚未完全了解但目前的研究认为主要的毒力因子有Vero毒素VerotoxinVTs紧密素intimin肠溶血素EnterohaemolysinEhx等VTs是肠出血性大肠杆菌的主要致病因子之一VTs包括两类生物学特性相似的VT

2、1和VT2它们可能由溶源性噬菌体VT噬菌体编码细菌的毒力强弱与噬菌体的感染密切相关因此对VT噬菌体的研究有助于揭示大肠杆菌O157:H7的致病机理对预防诊断和治疗大肠杆菌O157所致疾病具有重要意义为快速鉴定大肠杆菌O157菌株的毒力基因并了解其在菌株中的分布情况本试验采用针对毒力因子vt1vt2eaeAhlyA的多重PCR检测20株O157分离菌株结果010920株检测到vt1vt2eaeAhlyA四种毒力因子020324株检测vt2eaeAhlyA三种毒力因子其余18株菌株未检测到毒力相关基因选择具有代表性的3株菌株即ATCC43889010920020324进行小鼠毒力试验和Vero

3、细胞毒性测定结果显示不同菌株可引起Vero细胞不同程度的病变效应对小鼠也具有不同的致病力020324株比010920株对小鼠的I致死作用强表明菌株毒力因子与致病力之间存在相关性高致病力的大肠杆菌O157:H7的存在与菌株感染VT噬菌体形成溶源菌株有关本试验通过丝裂霉素C诱导只具有vt2基因无vt1基因的020324菌株释放噬菌体利用多种指示菌经双层琼脂平板法来分离纯化VT2噬菌体观察噬菌斑的特征提纯病毒粒子进行电镜观察并采用PCR的方法检测噬菌体中vt2基因结果显示VT2噬菌体感染MC1061在双层琼脂平板上形成的噬菌斑小而混浊多呈磨玻璃样而首次感染大肠杆菌CC118(pir),此后用MC

4、1061分离的噬菌体再以MC1061为指示菌的在双层琼脂平板上形成小而清晰透明的噬菌斑电镜下噬菌体头部呈六边形外廓尾部细长无尾鞘结构以噬菌体DNA为模板进行PCR扩增检测到vt2特异性DNA带确定编码VT2毒素的基因位于噬菌体上证实该菌株为VT噬菌体溶源性菌株相关研究在国内尚未见报道根据GenBank中VT2毒素的基因序列设计2对引物扩增噬菌体上vt2基因的全长AB亚单位将vt2-Avt2-B扩增产物纯化后分别插入pMD18-T载体测序结果登录GenBank同时利用软件DNAstar推导氨基酸序列并与GenBank中相应序列进行比较本试验vt2-Avt2-B基因的登陆号分别为AY73967

5、0AY739671vt2-A和vt2-B亚单位的基因序列与GenBank中编码VT2毒素的AB亚单位的核苷酸序列X07865NC_002655BA000007AF291819的同源性分别为98%-99%96%-100%AB亚单位的氨基酸序列与X07865同源性分别为98.8%和96.7%表明序列保守为进一步研究大肠杆II菌O157中VT噬菌体的毒力转换VT2毒素的表达和应用奠定基础关键词大肠杆菌O157:H7毒力基因VT2噬菌体vt2基因序列分析IIISTUDIESONVEROCYTOTOXIGENIC(VT)BACTERIOPHAGEINESCHERICHIACOLIO157ANDVTV

6、IRULENCEGENEABSTRACTEscherichiacoliO157:H7aremostimportantenterohemorrhagicE.coliserotype,whichcausingoutbreaksofdiarrhea,heamorrhagiccolitis(HC),hemolyticuremicsyndrome(HUS),eventhromboticthrombocytopenicpurpura(TTP)inhumanandanimalswithhighmortality.Althoughthemechanismofwhichfactorsmaketoxigeni

7、cE.coliO157morevirulenceisanopenquestion,todayseveralvirulencefactorshavebeenidentifiedasbeingofimportanceforthecharacteristicpathogenesisofO157infections,includingVerotoxins(VTs,encodedbythegenesvt),intimin(enco