小鼠釉基质丝氨酸蛋白酶成熟肽的克隆

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1、吉林大学硕士论文中文摘要牙釉质形成早期含有大量蛋白质，而完全矿化的牙釉质几乎不含有机质，有学者推测釉基质中存在蛋白酶水解清除了釉基质蛋白。EMSPI是从发育的釉基质中分离的第一个蛋白酶，也是目前第一个从蛋白质和DNA水平分离和定性的釉基质蛋白酶aEMSPi的基因在物种间高度保守，活性区由二硫键维系的注片层结构构成，活性区位于两个结构域之间。EMSPi是丝氨酸蛋白酶家族成员，由丝氮酸、组氨酸、天冬氨酸构成的催化三联体水解肤键。在釉质发育的分泌期，成釉细胞分泌釉原蛋白、釉蛋白、成釉蛋白、釉丛蛋白、丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶等形成奶酪样松软的釉基质结构，这层釉基质位于釉牙本质界，厚度即

2、将来形成的牙釉质厚度。釉基质蛋白被分泌后，立即被蛋白酶分解。被水解形成的小片段位于牙釉质深层(近釉牙本质界)，未被水解的釉基质蛋白因自身的疏水作用形成纳米球样结构，粘附在新形成的釉质表层，抑制矿物盐的沉积，阻碍釉质晶体增长。目前认为，EMSPi在釉质矿化的过程中发挥了主要的水解作用。经过蛋白酶的水解作用，釉基质蛋白小片段重新分布和定位:釉原蛋白和釉蛋白位于釉柱和柱间质，成釉蛋白位于釉柱鞘，在未来釉质矿化的过程中，它们在各自的位置发挥不同的功能。所以，有人认为蛋白酶除了水解釉基质蛋白外，还有调节釉质矿化的作用。釉基质蛋白的水解是一个复杂的过程。以釉原蛋白为例，在釉质发育的分泌期，

3、由Ca2+依赖性蛋白酶-MMP20水解掉完整的C-末端，形成23KDa和20KDa的釉原蛋白(20KDa的釉原蛋白相对稳定)，从而降低了釉原蛋白对轻基磷灰石晶体的亲合力。EMSPi在釉质发育的转换期和成占林大学硕士论文熟早期大量表达，经过MMP20水解去除6个氨基酸的前肤后被激活。激活的EMSPi主要水解和釉质晶体结合的20KDa疏水性釉原蛋白一一将富含酪氨酸的多肤片段(TRAP)水解掉，也可以水解非釉原蛋白或启动釉原蛋白的水解(即从25KDa水解成20KDa)o在碱性环境下，水解部位在Trp45和Leu46之间，并形成13KDa的产物(Leu46-ser148)，其氨基末端是

4、酪氨酸或亮氨酸。在酸性环境中，则形成11KDa的产物伽a63-Serl48)，其氨基末端是丙氨酸。TRAP片断还可在Gly43和Gly44再次被水解。当TRAP被水解后，釉原蛋白的水解产物还可以进一步被降解成更小的片断。经EMSPI的水解作用，产生的降解产物可溶于中性水溶液中，相对于疏水的釉原蛋白，可溶性大大增强，从而阻碍釉原蛋白凝聚成纳米球样结构，促进釉原蛋白从釉基质中清除。各种因素如果诱导编码EMSP1的基因缺陷，或各种原因导致其水解功能丧失或水解效能降低，就可能阻碍有机质成份的及时清除，从而导致不同程度的釉质发育不全(AmelogenesisImperfectaAI)。临

5、床上常见的氟牙症，就是F干扰了釉质的矿化过程，障碍或延迟了釉基质蛋白的清除，阻碍晶体沉积，以至釉质矿化不全。为进一步在分子水平研究EMPS1在釉质矿化中的作用，及其在釉质发育不全中的作用机制，本实验采用RT-PCR,嵌套PCR,touchdownPCR等分子生物学方法从小鼠牙胚组织中克隆EMSPi成熟肚cDNA序列，为后期表达EMSP1蛋白及制备核酸探针奠定基础。方法:提取出生后7天昆明小白鼠切牙、磨牙牙胚总RNA，逆转录为cDNA，设计两对特异性引物，采用嵌套PCR方法，扩增出小鼠EMSP1起始密码子至终止密码子基因片段。将目的基因连入pMD-18T载体，转化入大肠杆菌JM1

6、091通过蓝白筛选，挑出阳性克隆培养扩增，纯化重组质吉林大学硕士论文粒进行限制性酶切和核甘酸序列分析鉴定。结果:限制性酶切图谱和核甘酸序列分析结果表明所克隆cDNA为小鼠b93bp的EMSP1成熟肤基因。结论:本实验通过RT-PCR方法、嵌套PCR,touchdownPCR方法成功获得小鼠EMSP1成熟肤编码区的cDNA序列。为后期表达EMSP1及制备分子探针奠定基础。并在实验中摸索出一套克隆组织中微量蛋白基因的实验方法。关键词:小鼠牙胚EMSP1RT-PCR嵌套PCR克隆吉林大学60士论文ABSTRACTAsweallknowthatdevelopingenamelhadhi

7、ghproteincontentwhereasmatureenameldidnot.Thelossofenamelmatrixproteinsisproposedtheremustbesomeproteiansetodegradethesematrixproteins.EMSPIwasthefirstproteinasefractionatedfromthedevelopingenamelmatrix.Itisnowthefirstenamelproteinasetobeisolatedan