丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定.pdf

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1、!"卷#期微生物学报&’()!".’)#"$$"年%月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,-"$$"!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定"杜桂鑫侯利华陈万荣张永国王海涛""（军事医学科学院微生物流行病研究所北京0$$$10）摘要：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在病毒复制和包装中的重要作用使其成为特异性抗病毒药物研究的首选靶标。根据丝氨酸蛋白酶晶体结构特点，用柔性连接子连接.4#丝

2、氨酸蛋白酶结构域和.4!5的核心序列，构建成单链丝氨酸蛋白酶基因并且在大肠杆菌中获得高水平的可溶性表达，纯化后的目的蛋白能够切割重组蛋白底物.4678。随后，以单链丝氨酸蛋白酶为靶分子对噬菌体展示的随机十二肽库进行了三轮淘筛，挑选的!!个克隆中有#1个克隆能够特异性地结合丝氨酸蛋白酶，并且这种结合作用为竞争性9:;45试验结果所支持。对0#个克隆进行序列测定，得到%种序列，它们在氨基酸组成上存在明显偏性，富含组氨酸和色氨酸，缺乏酸性氨基酸；%种序列存在一个共有序列。关键词：丙型肝炎病毒，丝氨酸蛋白酶，噬

3、菌体展示，肽库中图分类号：<#1#文献标识码：5文章编号：$$$03%"$/（"$$"）$#3$"/=3$1丙型肝炎病毒（>?&）是导致输血后肝炎的主要病原，全球约有0@1亿感染者。尽管>?&感染后通常没有症状或者症状轻微，但=6A的感染者将发展为各种临床结局的慢性肝炎。目前尚无有效的疫苗用来预防病毒的传播而且常用的!3干扰素治疗效果也不理［0］想，因此研制更为有效的抗病毒药物是丙型肝炎研究中亟待解决的问题之一。>?&的.4#B!5丝氨酸蛋白酶在结构上属于糜蛋白酶超家族成员，参与病毒多聚蛋白在.4#3!

4、5、.4!53!C、.4!C365和.46536C位点的切割。由于丙型肝炎病毒的复制和多聚蛋白的加工是相偶联的过程，如果干扰丝氨酸蛋白酶的活性将破坏病毒的复制和成熟，从而实现抗病［"］毒作用。因此，丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白已经成为抗病毒药物研究的重要靶标。在>?&丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究工作中，除了合成化合物的筛选以及产物型抑制［#］［!］［6］剂的优化外，人们还尝试从生物分子组合库：如DE,E8’FG库、<.57HI7D-J库和骆驼［%］化抗体库（K7D-(EL-F&（>）F’D7E,7,IE8’FG）

5、中筛选抑制剂，并且取得了一些初步成果。/$年代初建立的噬菌体随机肽库技术，已被广泛应用在与分子识别相关的领域，极大地促进了小分子药物设计、抗病毒药物筛选、重组疫苗研制、蛋白结构解析以及表位分析等［1］方面的发展，也成为药物开发的一个有力武器。本研究中，我们基于>?&丝氨酸蛋白酶晶体结构的特点，构建了单链丝氨酸蛋白酶分子并在大肠杆菌中获得了可溶性表达，以该蛋白为靶分子，从噬菌体随机0"肽库中筛选特异性结合肽，期望能够为蛋白酶抑制剂"国家自然科学基金重点项目资助（#/%#$$"$）""联系人，参加工作还有刘

6、树玲、孙大铭。作者简介：杜桂鑫（0/1"2），男，北京房山人，军事医学科学院微生物流行病研究所，博士学位，主要从事丙肝病毒分子生物学研究。收稿日期："$$03$13"#，修回日期："$$030"30"&期杜桂鑫等：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶特异性结合肽的筛选和鉴定Laa的研制开辟一条新的途径。!材料和方法!"!材料!"!"!菌株和质粒：含有!"#$%&丝氨酸蛋白酶结构域基因的原核表达质粒’()*+&*+$%&$，本室构建并保存；带有,个组氨酸表达标签的原核表达载体’-)&.购自德国-/0+%%%=====

7、BB()$公司；大肠杆菌123［’4)5］：$6/%7849:;6<686>6;?7;@8A<0CD8，本室保存；缺陷型辅助噬菌体12&E.F，本室保存。!"!"#试剂：金属螯合亲和层析柱（$9+$G06>8HIA）购自德国-/0()$公司；5!JKJ+2L噬菌体展示随机十二肽库试剂盒，购自$AM)N>;6NOP9H;6QI公司；!45标记的抗12&单克隆抗体，购自5R68?6<96公司；重组蛋白底物$%36Q为本室制备并保存。!"#方法!"#"!单链丝氨酸蛋白酶基因的5"4组装：表达质粒’()*+&*

8、+$%&$含有!"#$%&$端2S2个氨基酸的编码基因，因酶切位点不适合，同时为了引入$%T0核心序列，设计&条引物用于丝氨酸蛋白酶基因的扩增和融合基因的组装。52U3V+"((0G""((GG"G(GG(GG0GG(GG(GG0(00GG0GGGG0G"G((G+&V；5LU3V+0GG0GGGG0G"G((G0(G((G0(G0G"0"((""G0"G"""00+&V；5&U3V+"""00("GGGG0((0""("0G((G0(GG