小麦淀粉合成关键酶反义基因的构建及转化

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1、河南农业大学硕士学位论文小麦淀粉合成关键酶反义基因的构建及转化姓名：姚秋菊申请学位级别：硕士专业：植物学指导教师：杨好伟20030401致谢本实验是在导师杨好伟教授的悉心指导下完成的，实验的全过程，处处都凝聚着杨老师的心血，他严谨的治学态度，一丝不苟的科研精神，让我终身受益。此时此刻，谨向恩师表示最衷心的感谢。本论文是在河南省农业科学院农作物新品种重点实验室完成的，英籍Dr．joyfleming在实验及论文写作过程中给了很大帮助，她求实的科研态度和坚韧不拔的求学精神让我懂得了如何更好地学习和生活。特别感谢河南省农科院陈占宽老师，在实验设计与实施过程中，得到了陈老师的悉心指导和热情帮助，

2、从陈老师的身上，我不仅学到了科学知识，而且学到了许多思考问题的方法，这一切都让我受益匪浅。感谢河南省农科院郅玉宝、易明林等很多老师和苗红梅博士、李翠香等同学在实验过程中给予的帮助和支持，感谢好友张莉在论文整理过程中给予的帮助。感谢植物学专业的各位老师在三年的求学生涯中给予的指导、支持和鼓励，三年的学习，使我在知识方面得到了充实，更使我在如何进行科研工作方面领悟到了很多。感谢周修任、袁志良、李家美、李孝伟等同门弟子在实验及论文完成过程中提供的帮助和支持。感谢陈占宽老师和植物学专业崔红老师对论文的修改和评阅。感谢我的爱人魏国强先生三年来对我极大的支持和鼓励，最后，对给予我关怀和支持的老师以

3、及所有帮助过我的同学、朋友和亲人表示真诚的感谢。姚秋菊2003年6月于郑卅I摘要淀粉是许多粮食作物的重要贮存多糖，在食品、工业等方面有着广泛用途，因此，改良淀粉品质具有重要意义。AGP、GBSS、SBE是淀粉生物合成关键酶，决定着淀粉含量及直度链淀粉的比率，从而影响其品质。本研究的目的是通过改变淀粉生物合成途径来影响小麦淀粉的量及直度链淀粉的比率，其策略和技术路线为利用反义基因技术抑制小麦胚乳中某一淀粉合成关键酶基因的表达。实验成功构建了AGP、GBSS、SBE的一系列反义基因，以确定有效抑制片段长度。以AGP、GBSS、SBE全长编码基因反向替代pCAMBIAl301．MAR-LI中

4、的ipt基因构建了三个全长反义表达载体，并利用适当酶切、连接的方法构建了一系列反义缺失体。所有这些反义基因表达载体在外源基因外侧添加了小麦核骨架结合序列(MAR)，MAR不仅可以克服外源基因表达的位置效应，而且可以提高外源基因的稳定性和表达水平，目的基因的启动子为小麦LMWGluIDl基因启动子，该启动子可以使外源记基因在小麦胚乳特异表达，具有很强的启动活性。将构建好的一系列反义表达载体利用基因枪方法导入小麦(郑麦9023)花后12·14天的幼胚，通过组织培养和抗性筛选(Hyg20rag／1)，获得了抗性植株。实验共轰击了3600个幼胚，获得了98株抗性苗，经PCR检测，其中22株为阳

5、性，转化率为0．61％，表明外源基因已成功整合进小麦基因组。关键词：淀粉，AGP，GBSS，SBE，反义基因，构建，基因枪，转化，小麦一文献综述本研究是建立在淀粉生物合成的分子生物学基础上，以期利用基因工程手段来改良小麦胚乳的淀粉品质。在此就淀粉生物合成、淀粉基因工程、小麦遗传转化及反义RNA技术等方面的问题做一简单综述。1淀粉生物合成及相关酶的研究进展淀粉是许多粮食作物(如小麦、玉米、水稻等)的种子、马铃薯块茎和多种植物块根(如甘薯、木薯等)的重要贮存多糖(Visser，1994)。淀粉不仅为人类提供70％一80％的能量，并作为工业原材料广泛用于食品、医药、饮料、造纸、包装、纺织和化

6、工等工业中(RichardGF．Visseretal，1993；ReyLWhistleretal，1997；EM．Deyetal，1997；Z．Lietal，1999)。淀粉根据结构不同分为：直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)，二者基本结构相同，但链长度和分支程度不同，从而具有不同的理化特性。直链淀粉是由a一1，4．糖苷键连接而成的线性多聚糖，分子量小，在水中易形成凝胶；支链淀粉是由a—l，4．和a一1，6．糖苷键连接而成的具有分支的多聚糖(RichardGF．Visseretal，1993；ReyLWhistleretal，1997；P．M．Deyetal

7、，1997)，分子量大(一般为直链淀粉的1000倍)，水溶性的黏度较高。因此直／支链淀粉的含量及其比例影响着淀粉的结构和理化特性(Martin，1995)，进而影响着淀粉的功能和应用领域。1．1淀粉的生物合成在高等植物中，淀粉合成的主要场所是叶绿体和造粉体。在叶绿体中淀粉在光下合成、暗中分解，贮藏时间较短，常称为“临时淀粉”；在造粉体中合成的淀粉则稳定积累达几个月甚至几年，称为“贮藏淀粉”。人类利用的淀粉主要是贮藏淀粉。在叶绿体中，参与淀粉合成