玉米淀粉合成关键酶基因shys的遗传转化

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1、山东农业大学硕士学位论文玉米淀粉合成关键酶基因shys的遗传转化姓名：屠培培申请学位级别：硕士专业：作物遗传育种指导教师：孙庆泉20120614山东农业火学硕士学位论文中文摘要玉米是世界第二大粮饲兼用作物，随着加工业的不断发展，玉米的需求量也与日俱增。用基因工程方法将优良基因转入优良玉米自交系是当前玉米高产育种的重要途径之一。腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)是淀粉生物合成过程中的限速酶，受Pi负调节，其中2个负调节位点在调节亚基Sh2上，突变后的基因命名为shys，可提高AGPase活性，进而提高作物总淀粉的合成效率。本研究以玉米自交系A188、齐319和18．59

2、9为试材，对农杆菌浸染强度进行了优化，对影响基因枪转化效率的因素进行了探索，并用农杆菌介导和基因枪轰击两种方法转化了玉米淀粉合成关键酶基因shys。研究的主要结果如下：1．农杆菌浸染强度对愈伤转化效率及植株再生有重要影响。A188浸染强度为OD600=0．4、浸染时间为15rain时褐化率最低，分化率最高；18—599的最佳浸染强度组合是OD600=0．6、浸染时间20min。2．轰击距离、轰击次数以及质粒DNA用量对愈伤组织的转化率有较大影响。18．599材料最佳轰击参数为轰击距离9．5cm、轰击次数2枪，质粒浓度1．0腭；齐319在轰击距离9．5cm、轰击次数l枪，质粒浓

3、度1．0ttg时愈伤组织后期筛选的褐化率最低，转化效率最高。3．生根壮苗培养基对抗性苗的生根有利。生根粉ABT浓度为O．5mg·L’1时A188和齐319生根情况均良好，18．599幼苗在ABT浓度为1．5mg·Ld时利于生根，平均生根条数3根，平均根长可达2．6cm。4．农杆菌浸染法获得400株抗性植株，经PCR检测获得了15株A188转化株和19株18．599转化株，阳性苗得率为8．5％，再经RT-PCR检测得到3株A188阳性株和6株18．599阳性株，阳性苗得率为3．5％；基因枪法共得到195株抗性苗，PCR检测共有13株苗呈阳性，其中齐319三株，18．599十株，

4、阳性苗得率为6．7％，RT-PCR检测时齐319和18．599阳性株各2株，阳性苗得率为3．2％。部分Southem杂交结果显示有明显的杂交条带。农杆菌的转化效率略高于基因枪。5．转基因苗移栽大田后，套袋隔离，自交结实，收获了18-599和齐319材料T0代的种子。关键词：玉米：自交系；农杆菌介导；基因枪：浸染强度；分子检测玉米淀粉合成关键酶基因shys的遗传转化GeneticTransformationofGeneshysoftheKeyEnzymeforStarchSynthaseonMaizeABSTRACTMaize(ZeaMaysL．)isthesecondlarg

5、estcerealcropandfoddercropintheworld．Withthecontinuousdevelopmentofprocessingindustry，thedemandofmaizeisalsoincreasing．Itisoneoftheimportantwaystocombreedingforhighyieldthattransfergoodgenesintoexcellentinbredlines、)vitllthegeneticengineering．Inrecentyears，theresearchofthisfieldhasmadealoto

6、fprogress．AGPaseisakeyenzymeinstarchbiosynthesisandisregulatedbyPinegatively．TwoofthenegativeregulatorysitesareontheregulatorysubunitSh2，andthemutatedgeneisnamedtheshys．ItimprovestheactivityofADPglucosepyrophosphorylaseandthenincreasescropstarchsynthesisefficiency．Inourstudy，maizeinbredline

7、sA188，Qi319，and18-599wereusedastestmaterials．TheAgrobacteriumdipstrengthwereoptimizedandthefactorsthataffectbiolistictransformationefficiencywerestudied．ThenthecomstarchbiosynthesisgeneshysWastransformedbyAgrobacterium-mediatedtechniqueandgenegunbombardm