家蝇乙酰胆碱酯酶基因的克隆、表达和分子进化的研究

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1、●上海海洋人学硕士学位论文获得的工程文件在Swiss．PdbViewer软件中打开进一步分析，模拟不同位点的氨基酸突变，确定对该蛋白的A262、Y327和1374位点进行了单一或组合突变，实施人工分子进化，测序验证分子进化完成。3．构建了一系列家蝇乙酰胆碱酯酶基因及突变体的酵母真核表达载体，将家蝇乙酰胆碱酯酶基因及突变体的酵母真核表达载体电击转化毕赤酵母GSll5中，得到了其各自表达菌株。进行条件优化，确定发酵条件为：接种量1％，转速280rpm，发酵温度30℃。通过甲醇诱导进行高效表达，获得AChE及其突变

2、体。4．对AChE及其突变体进行酶活测定，突变体酶活相对于原始AChE有不同程度的提高，其中突变体GDD的发酵单位达到了75．5U／ml，为原始AChE的3．5倍。5．突变后的重组酶与底物的亲和力有不同程度提高，特别是三突变体GDD(突变位点为A262G、Y327D和1374D)对底物的亲和力较原始AChE提高较大，说明262、327和374三个位点对AChE的活性有较大的影响。6．K及lC50的测定结果显示，突变后的AChE对七种农药的敏感性都不同程度得到提高。其中，单突变体A262G和Y327F对农药的敏

3、感程度比较接近；双突变体GF和GD对三种农药的敏感性比相应的单突变体要高；三突变体GDD对灭多威的敏感性是突变自订的16倍，对克百威和毒死蜱的敏感性均是突变前的14倍。本研究获得的重组AChE可以用来对蔬菜、瓜果中的有机磷和氨基甲酸酯类农药残留进行检测，为发展新型酶法检测农药残留技术以及农药的设计和筛选提供了高效的酶源，在食品安全农药残留检测领域具有很大的应用价值。关键词乙酰胆碱酯酶，家蝇，定向分子进化，毕赤酵母，农药残留，酶动力学分析II●■ABSTRACTThesecurityoffoodandagric

4、ulturalproductsisamajorglobalissue，andpesticideresidueinagriculturalproductsisasocialproblemwithexcessiveattention．Currently,insecticideresiduesareroutinelydeterminedbychromatographicmethodsandenzymeinhibitionmethodinChina．Chromatographyorothercombinationso

5、fmethodsrequireextensivesamplepreparation，specializedanalyticalequipment，andtechnicalexpertise，whichareallunsuitableforrapid．immediateandlarge-scalesampleanalysis．TheenzymeinhibitionmethodiSapromisingalternativetechnique，whichdetectsOPandCBpesticidesviaarap

6、idandsimpleprocedure．Thismethodiswidelyusedtodetectresidualpesticidesinfruitandvegetables．neprincipleofenzymeinhibitionmethodasfollowed，OPandCBpesticidescouldinhibittheactivityofAChE(Acetylcholinesterase，AChE，EC3．1．1．7)，however,thewidelyapplicationofthismet

7、hodwaslimitedbytwoissues．Firstly,thesensitivityofAChEiSunstable，then，AChEwaspurifiedfromtissuesorblood．thesesourcesarelimitedandpurificationiSbothtimeandcostintensive．Generally,insectAChEiSmoresensitivetoabroadrangeoftoxicchemicalsthanthatofthevertebrate．an

8、dthedipteranenzymeiSinturnmoresensitivetoOPandCBinsecticidesthanthatofthehelipteranorcoleopteran．Also，housefly(Muscadomestica)AChEiSknowntobeinactivatedbyOPandCBinsecticides．Also，AChEwithhighersensitiv