EBV-LMP2多表位肽免疫效应的研究

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1、温州医学院硕士学位论文中文摘要目的：1．预测和筛选EBV—LMP2多表位肽：预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的CTL和Th细胞表位，选择评分较高的CTL和Th表位，并结合本实验室预测的EBV-LMP2B细胞表位【1J，获得EBV-LMP2多表位肽序列。2．EBV．LMP2多表位肽的基因克隆及其原核蛋白表达和纯化：构建含EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒pET32a(+)／EBV．LMP2多表位肽，经IPTG诱导后用Westernblot进行特异性鉴定。采用Ni．NTA树脂亲和层析法纯

2、化融合蛋白EBV．LMP2多表位肽。同时纯化pET32a(+)表达的His蛋白用于动物免疫和ELISA检测的对照研究。3．利用小鼠检测EBV．LMP2多表位肽的免疫原性：将纯化的EBV-LMP2多表位肽hi]His蛋白分别免疫BALB／ctJ、鼠，隔周免疫，共3次。采用ELISA方法分析免疫后小鼠血清IgG及阴道分泌物slgA水平及维持时间，并采用EBV抗原(B95．8细胞制备)作为阳性对照。同时，在末次免疫后1w无菌取小鼠脾细胞用LDH释放法进行CTL杀伤活性分析，以检测EBV-LMP2多表位肽免疫

3、小鼠后诱导的特异性细胞免疫效应。本研究初步分析了EBV-LMP2多表位肽免疫原性，为EBV感染相关疾病的表位疫苗设计及研制相关诊断试剂奠定了基础。方法：1．以EBV标准株(B95．8细胞)LMP2的完整氨基酸序YU(497aa)为基础，应用在线预测网站SYFPEITHI(．http：／／www．syfpeithi．de／)，预测EBV-LMP2的H2一Kd、HLA．A*0201、HLA．A'2402、HLA-DRBl·0401、HLA．DI迅1"0301、HLA—DI也1}1501等限制性表位，尤其是

4、HLA．A*0201、HLA．A'2402、H2．kd重叠的区域，选择含CTL、Th表位富集的肽段。结合本实验室已经报道的EBV-LMP2B细胞表位⋯，选择B细胞表位及CTL、Th细胞表位富集的肽段作为多表位肽的候选序列。2．将EBV-LMP2多表位肽的核酸序列交由生物公司合成，并将其插入原核质粒pET32a(+)，构建含有His标签的重组质粒pET32a(+)／EBV-LMP2多表位肽。经IPTG诱导表达后的融合蛋白进行SDS．PAGE蛋白电泳，并用Westernblot鉴定其免疫原性，用Ni．NT

5、A树脂亲和层析法纯化融合蛋白EBV-LMP2多表位肽及His蛋白。3．选择6~8周龄雌性BALB／c小鼠，分3组，即EBV-LMP2多表位肽组、His蛋白组及PBS组，每组9只。将纯化后的融合蛋白EBV-LMP2多表位肽及His蛋白与佐剂等体积混匀后按照50pg／只剂量分别免疫小鼠，采用背部皮下多点注射的方温州医学院硕士学位论文式，共免疫三次。首次免疫及每次免疫后1w断尾取血并收集阴道分泌物，采用ELISA法检测血清中特异性IgG和阴道分泌物中特异性slgA水平。同时，于术次免疫后1w，每组随机取3只

6、小鼠，无菌取脾脏，制备脾细胞进行CTL细胞特异性杀伤活性检测，采用乳酸脱氢酶LDH释放法检测其特异性细胞免疫效应。其余小鼠持续检测其特异性血清IgG和阴道分泌物特异性sIgA的持续水平直至第7w。结果：1．从SYFPEITHI网站预测到的候选CTL和Th表位中选择出19条评分较高的肽段，结合本实验室已经预测的EBVoLMP2B细胞表位⋯，选择CTL和Th细胞富集的肽段，即EBV-LMP2195．232和EBV-LMP2419．435肽段，将两段序列串联，即得到EBV-LMP2多表位肽序列。2．酶切鉴定

7、和核苷酸测序结果表明，成功构建了含有EBV-LMP2多表位肽的原核重组质粒pET32a(+)／EBV-LMP2雾；位肽。SDS．PAGE分析，在37℃，1．0mMIPTG作用下诱导6hr能很好地表达目的蛋白，相对分子质量(脚)约为27kDa，与预期腑大小吻合；蛋白表达量约占细菌总蛋白量的23％。WesternBlot结果显示，以HRP标记的小鼠抗His．IgG(H+L)作为一抗，则可见单一明显条带，与SDS．PAGE中位置吻合。用Ni．NTA树脂亲和层析法分别纯化得到表位融合蛋白EBV．LMP2多表位

8、肽和pET32a(+)所表达的His蛋白。3．BALB／c小鼠经融合蛋白EBV-LMP2多表位肽免疫后，可获得高效价的血清特异性IgG。血清抗体效价随免疫次数增加而升高，自第1w开始升高，可持续至第7w。用融合蛋白EBV-LMP2多表位肽蛋白包被并将血清按1：100稀释，检测第7w小鼠IgG抗体水平：EBV-LMP2多表位肽组A值为(1．178士0．130)，His蛋白组及PBS组分别为(0．468+0．121)，(0．016+0．008)；EBV，LM