人椎间盘细胞外基质蛋白的质谱研究

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1、957373聊博士学位论文(2006届)人椎间盘细胞外基质蛋白的质谱研究IdentificationoftheExtracellularMatrixProteinsoftheIntervertebralDiscbyTwoDimensionalElectrophoresesandMassSpectrometry研究生姓名墨丝主指导教师姓名廑盔塑f塾筮2专业名称盈登堂研究方向叠蕉论文提交日期2QQ鱼生垒旦人椎问盘细胞外基质蛋白的质谱研究中文提要椎间盘组织是一种软骨组织，由位于中央的胶冻样的髓核和外周呈同心圆排列的纤维环组成，在人体起着支撑和承受负荷的作用，椎间盘组织发生病变时

2、可以引起相应的局部及神经根刺激症状。以往对于椎间盘退行性疾病的基础研究中，大多集中在胶原蛋白，包括基因及蛋白质水平的研究。但近年来对于关节软骨的蛋白质组学研究结果表明，胶原网络的形成更多地是靠胶原蛋白分子之间的小分子蛋白的连接而形成的，在胶原网络的崩解过程中起关键作用的未必是胶原蛋白分子本身，更可能的是因为形成胶原网络的这些细胞外基质小分子蛋白的某些改变导致了胶原网络的崩解从而进一步发生的胶原蛋白分子的变性碎裂，最终导致椎间盘的退变。但是关于椎间盘的退行性疾病的蛋白质组学研究至今未见报道。对于软骨退变的研究一个主要的目的就是要寻找一种可靠的生物标记物，可以作为可靠的诊断指

3、标，在对于胶原蛋白的研究中己取得了一些成绩，但细胞外小分子蛋白的改变更可能是先于胶原蛋白的变化而且是更为关键的因素，故能比胶原蛋白更早地预示退变的发生，而且这些蛋白变化的位点很可能就是某些药物作用的位点，正是基于这样考虑，对于细胞外基质小分子蛋白的蛋白质组学研究就具有了更加重要的意义本实验采用了蛋白质组学的方法，包括双向凝胶电泳，质谱仪鉴人椎间盘细胞外基质蛋白的质谱研究中文提要定，对人的正常椎间盘组织内的细胞外基质小分子蛋白进行了初步的研究和分析，取得了有益的结果。第一部分预实验牛椎间盘的细胞外基质小分子蛋白的电泳分离及质谱分析目的：通过对牛椎间盘进行蛋白萃取，电泳分离以

4、及质谱分析检验实验设计的可行性。方法：使用Heinegard的方法对牛椎间盘进行萃取，将萃取液上样进行SDS—PAGE梯度电泳分离蛋白质，将分离的蛋白质条带进行染色切割，使用胰岛素酶进行消化，使用基质辅助激光解吸附质谱仪进行蛋白质鉴定。结果：结果显示牛椎间盘萃取蛋白质在分子量16--250Kd范围内能够被很好的分离，通过质谱鉴定可鉴定出蛋白质种类，在所鉴定的蛋白质中不含胶原蛋白的成分。说明这种萃取方法不会破坏胶原网络。第二部分正常人椎间盘细胞外基质小分子蛋白的质谱鉴定研究目的：通过使用预实验所确立的方法，对正常人的椎间盘组织进行蛋白质萃取，两维电泳分离及质谱鉴定，来确立正

5、常人椎间盘细胞外基质小分子蛋白的蛋白质谱，为今后的进一步研究奠定基础。方法：使用Heinegard的萃取方法获得萃取液，并通过超高速离心除去萃取液中的蛋白多糖成分，通过两维电泳分离蛋白质，把确认的蛋白质点切割并进行胰岛素酶消化，然后使用基质辅助激光解吸附质谱仪进行蛋白质鉴定。结果：双向电泳显示，纤维环和髓核的细胞外基质小分子人椎间盘细胞外基质蛋白的质谱研究中文提要蛋白无明显差异，纤维环和髓核中的小分子蛋白在pH3～10分子量16kd～250kd．范围内能被很好地分离，对各蛋白质点行质谱仪鉴定，分别确定了其中相同的19种蛋白质。结论双向电泳可有效地分离椎间盘组织中细胞外基质

6、小分子蛋白，通过质谱仪鉴定可以确定其组成成分，为进一步研究椎间盘软骨细胞外基质小分子蛋白的功能及在椎间盘病变中的改变和所起的作用打下基础。第三部分退变椎问盘和正常椎间盘组织的细胞外小分子蛋白质谱鉴定结果的对比研究目的：通过对退变的椎间盘组织的细胞外小分子蛋白进行两维电泳分离和质谱鉴定，和正常的人椎间盘组织细胞外小分子蛋白质谱进行对比，以图发现不同。方法：使用罹患椎间盘突出症患者手术中取出的椎间盘组织进行蛋白萃取，超高速离心取出蛋白多糖，两维电泳分离，质谱仪鉴定。结果：在完全相同的条件下对退变的椎间盘组织进行实验的结果显示出了非常明显的不同之处，既在两维电泳凝胶上退变的椎间

7、盘组织蛋白质COMP的明显缺失，经过大量重复实验验证了不同之处的可重复性和稳定性，确定了下一步的研究对象。第四部分针对COMP及其裂解片断的研究目的：通过以往的实验中我们确立了以COMP为研究对象的研究方向。而某种蛋白的缺失主要是因为它本身发上了裂解而造成的，在以往对于关节软骨的研究中发现，COMP的裂解位点一般是恒定的，人椎间盘细胞外基质蛋白的质谱研究中文提要故这部分实验的目的是寻找该蛋白的裂解片断，确定其裂解位点，为制备其特异性的抗体做准备。方法：WesternBlot，硝酸银染色及ELISA等方法。结果：这部分实验的进行